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ala88
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Prov.: Ge
Città: Genova
7 Messaggi |
 Inserito il - 06 maggio 2010 : 22:16:30
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Durante la corsa su gel d'agaroso per vedere se è avvenuta la ligation appaiono delle bande di peso molecolare poco superiore agli inserti solo nei campioni dove è stata messa la ligasi, nei controlli non sono presenti.
Qualche consiglio su cosa possa essere successo? grazie in anticipo.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2010 : 22:33:58
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| puoi essere + specifica? la corsa l'hai fatta dopo digestione per rimuovere l'inserto?quanto è l'inserto in termini di kb e quanto sono invece le bande che trovi tu? quanto è grande il vettore? hai eseguito un directional cloning (due siti di restrizione diversi)? infine, qual era la concentrazione di agarosio? |
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ala88
Nuovo Arrivato
Prov.: Ge
Città: Genova
7 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2010 : 22:43:53
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| La corsa è stata fatta unicamente per vedere se la ligation è avvenuta, il plasmide pGEX6p1 è sulle 4900 bp, ho eseguito un directional cloning per entrambe i miei inserti uno è di 1000 bp l'altro di 1200 bp, in ambedue i campioni dove metto la ligasi su gel non vedo inserto come se fosse tutto legato ma compare una banda di ca 100-200 bp maggiore dell'inserto. La corsa è stata fatta sia su un gel al 2% che su uno al 1.7%. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2010 : 23:22:20
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capisco... beh un pò difficile da interpretare. Mi chiedo però se abbia senso correre il prodotto della ligation appena ottenuto... Nel tubo di reazione, dopo l'aggiunta di ligasi, avrai molecole a diverso peso molecolare dovute alla ligazione casuale dei vari elementi genetici che hai introdotto (plasmide-plasmide-specie che però non si forma e non ricircolarizza se è stato completamente digerito e completamente defosforilato- inserto-inserto, plasmide-inserto e così via). Se hai preso tutti gli accorgimenti necessari e i controlli sulla digestione, con la trasformazione hai la selezione vera e propria e teoricamente il prodotto finale che ti ritrovi alla fine è il tuo bel plasmide-inserto. Non è sempre così ovviamente ma a monte si possono osservare casi di incompleta digestione/defosforilazione, casi + o - rari di inserzione multipla dell'inserto ecc.
io dopo la ligation non corro su gel, procedo direttamente alla trasformazione. dopo quando ottengo le colonie controllo che cosa ho per le mani (digestione e corsa su gel, pcr, sequenziamento ecc).
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ala88
Nuovo Arrivato
Prov.: Ge
Città: Genova
7 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2010 : 23:25:33
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| sìsì, comunque eseguirò una pcr su colonie e una digestione del plasmide estratto dalle colonie in seguito, ma ero solo curioso di sapere cosa potesse essere successo. |
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kekkopad
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3 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2010 : 14:51:06
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E' veramente difficile capire cosa sia successo, in ogni caso potrebbe essere una forma diversa di avvolgimento del plasmide ligato, il fatto che sia piu' alto potrebbe essere dovuto semplicemente al fatto che il plasmide con l'inserto clonato sia a quell'altezza. In ogni caso devi considerare che hai li una serie di molecole, plamide senza inserto, solo inserto, solo vettore, o combinazioni varie, quindi in effetti valutare il prodotto di ligation non da informazioni sicure. Trasforma e poi controlla.
A presto |
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Problemi nella ligation
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