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c
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
 Inserito il - 07 maggio 2010 : 14:52:57
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Salve,
vorrei sapere quanto è attendibile il sequenziamento automatico di un frammento di PCR di un gene eucariotico eseguito con entrambi i primers (FOR e REV) rispetto al risultato ottenuto solo con uno dei due primer.
E ripetere il sequenziamento con lo stesso primer (sempre FOR o sempre REV) equivale forse, come attendibilità dell'analisi, a eseguire la sequenza con entrambi?
Grazie!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2010 : 15:31:37
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| Il sequenziamento con entrambi i primers è necessario quando il frammento è molto lungo (>800-1000 bp) in quanto più è lungo più alla fine il sequenziamento diventa meno attendibile.Per questo è utile disegnarsi due primer, uno forward e uno reverse, oppure uno forward e un altro sempre forward ma disegnato + a valle. Le sequenze ottenute generalmente si sovrappongono parzialmente (che ti può servire anche da controllo) e vengono assemblate (tramite opportuni software abbastanza semplici da usare)in modo da darti la sequenza completa del tuo inserto. Il sequenziamento viene ripetuto con lo stesso primer se per esempio la prima volta qualcosa è andato storto e non hai un risultato attendibile. spero di essere stato chiaro... |
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c
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2010 : 09:26:17
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Grazie, sei stato molto chiaro. Quindi se ho capito bene, nel caso si ottenga una sequenza perfetta con un solo primer, nella regione di interesse, non è necessario ripetere nè con lo stesso primer nè con quello della direzione opposta, giusto? Ma allora perchè si dice che è meglio usare entrambi i primer perchè si potrebbe non vedere una mutazione (parlo sempre di frammenti di PCR derivanti da DNA eucariotico)? In fin dei conti la possibilità che uno dei due alleli non venga sequenziato esiste comunque al di là di quale pimer uso, giusto?
grazie! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2010 : 09:41:21
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Mah, io credo che questa possibilità (cioè di non vedere una possibile mutazione) esista o sia + frequente nel caso di sequenziamenti molto lunghi. Certo non è sempre così: Tempo fa mi ritrovai a sequenziare un cDNA di circa mille paia di basi, usai due primer e la prima volta non andò bene (uno dei primer per qualche motivo che non conosco non funzionò). Feci ripetere il sequenziamento e fu tutto ok. Per un altro cDNA di 4200 bp usai 4 overlapping primers e non ebbi problemi.
Se hai un frammento molto corto (400-600 bp) secondo me un primer basta e avanza. Per geni più lunghi direi di usare + primers. Poi è chiaro che se vuoi essere sicuro di avere al 100% un buon sequenziamento nessuno ti vieta di usare + primers in contemporanea... Non sempre la reazione di sequenziamento ti da un risultato chiaro e soddisfacente, voglio dire che c'è sempre la possibilità di avere errori durante la reazione e quindi hai una sequenza illegibile.
Tieni infine conto che utilizzare due primer opposti (in due reazioni separate) ti da una sicurezza maggiore sulla "veridicità" della sequenza, cioè controlli due volte in un senso e nell'altro la tua sequenza, quindi se hai risultati uguali puoi star sicuro che la tua sequenza è ok.
Questo è quello che so per esperienza personale, poi ci potrebbero essere altri motivi per cui si utilizzano + primers, non so... |
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