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amicia
Nuovo Arrivato

24 Messaggi

Inserito il - 19 maggio 2010 : 16:29:33

Ciao a tutti,
qualcuno di voi ha mai fatto PCR assimetriche sbilanciando la concnetrazione dei due primers in modo da generare frammenti a singolo filamento?
Conoscete quaclhe altra tecnica comunemente usata per generare frammenti a singolo filamento?
Grazie mille a tutti

Neuroscience
Utente

659 Messaggi

Inserito il - 19 maggio 2010 : 19:55:53

La tecnica che hai elencato presenta diverse problematiche.
Non basta sbilanciare le concentrazioni dei due primers, poich� gi� ne metti miliardi di volte superiore alla quantit� di templato. Il secondo problema � che sbilanciando il sistema avrai una crescita esponenziale del db ed una misera quantit� single strand. Il terzo problema � che comunque dovresti poi separare il DNA ds e ss.

basta fare una semplice PCR, poi denaturare il frammento ds ed ottenere una mix dei due singoli filamenti...
per separarli gel di acrilamide non denaturante, a patto che non siano troppo grandi 100-200 bp. Per frammenti pi� grandi dovresti ricorrere ad una cromatografia dedicata

Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 19 maggio 2010 : 20:35:01

Per generare DNA a singolo filamento so che una
volta si utilizzavano vettori fagici basati su f1

Volere libera : questa � la vera dottrina della volont� e della libert�
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2010 : 10:15:07

In effetti credo che il metodo che Dionysos ti ha suggerito sia il pi� utilizzato, guardacaso moltissimi plasmidi sono dotati di una origine di replicazione F1 (F1 Ori) che viene usata per la produzione di ssDNA