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Discussione |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
 Inserito il - 24 maggio 2010 : 12:54:15
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salve a tutti,
dovrei preparare dei campioni di proteine derivate da cellule in coltura. Poichè per il dosaggio uso la sonicazione mi chiedevo se questa danneggiasse irreversibilmente le proteine da renderle non funzionali per un blot
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il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2010 : 14:40:18
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| in che senso usi la sonicazione per il dosaggio? io sonico sempre i campioni durante l'estrazione delle proteine, prima di centrifugarli, e non ho mai avuto problemi con i western successivi... |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2010 : 15:10:45
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| bene era questo che volevo sentirmi dire... avevo paura che la sonicazione rovinasse in qualche modo le proteine... |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2010 : 15:12:18
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| se le sonichi per troppo tempo puoi danneggiarle |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2010 : 16:25:53
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Io nei miei campioni ho una proteina reporter fluorescente che
emette anche nel visibile (arancione) e che mi colora allegramente
gli omogenati, solo quando è foldata ovviamente. Tenendo conto che
ogni proteina ha una sua sensibilità alla denaturazione e ancor più
alla degradazione, ti dico che dopo 30 impulsi da 0.5 secondi alla
massima potenza del sonicatore, ancora rimane il colore arancione... |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2010 : 17:22:07
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Io nei miei campioni ho una proteina reporter fluorescente che
emette anche nel visibile (arancione) e che mi colora allegramente
gli omogenati, solo quando è foldata ovviamente.
che figata che proteina è? |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2010 : 13:19:58
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infatti... la voglio anch'io!! :D |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 10:24:02
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Ti confermo anch'io che la sonicazione non danneggia assolutamente le proteine.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 12:57:24
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Citazione:
Messaggio inserito da memole
Ti confermo anch'io che la sonicazione non danneggia assolutamente le proteine.
Non sono molto convinto di questa cosa...
L'estensiva sonicazione può denaturare le proteine (e questo risulta un danno se la denaturazione è irreversibile). Questo avviene per il riscaldamento conseguente alla sonicazione. Poi dipende cosa ci devi fare con queste proteine... Se è solo estrazione/SDS-PAGE-W.B. immagino che nn costituisca un grosso problema, ma se ci devi fare immunoprecipitazioni o lavori con proteine chimeriche io farei attenzione. |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 13:00:01
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Grazie per l'informazione Spemann. Io ci lavoro da poco e non ho molta esperienza, chi lavorava prima di me mi ha detto che per i nostri studi problemi non ce ne sono, ma terrò presente quello che dici.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 13:32:23
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| di nulla :) |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 18:01:15
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Confermo per le immunoprecipitazioni: chi se ne occupa da
queste parti sostiene che per mantenere intatti i complessi
multimerici siano necessarie attenzioni particolari nella
sonicazione. L'attività biologica di molti enzimi si conserva
bene anche dopo sonicazione (provato personalmente su idrolasi)
per cui puoi anche fare saggi dell'attività enzimatica.
Se invece farci WB con SDS-PAGE, allora la denaturazione
e la dissociazione non solo non preoccupano, ma sono anzi
auspicabili! |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 19:25:28
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Io faccio elettroforesi bidimensionale...Secondo voi ci sono problemi? A questo punto qualche dubbio mi viene.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 19:56:28
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Citazione:
Messaggio inserito da memole
Io faccio elettroforesi bidimensionale...Secondo voi ci sono problemi? A questo punto qualche dubbio mi viene.
direi di no. Come ti ha detto anche Dyonisos, se il tuo scopo è analizzarle per sds-page (o per bidimensionale) che te ne frega se si denaturano? Nella bidimensionale prima separi le proteine secondo il loro peso molecolare (e quindi le denaturi) poi secondo il loro punto isoelettrico, quindi nn dovresti correre rischi |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 20:48:48
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Veramente in prima dimensione le separo tramite IEF, quindi secondo il loro punto isoelettrico, ed in seconnda faccio una SDS-PAGE, denaturando il campione  .
Grazie ancora per le delucidazioni.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2010 : 21:52:52
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| non cambia nulla ;) |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2010 : 17:51:24
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Messaggio ricevuto. Grazie ancora Spemann
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Discussione |
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preparazione proteine per blot, sonicazione?
Didattica
