| Autore |
Discussione |
|
|
mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
 Inserito il - 07 giugno 2010 : 16:30:29
|
Qualcuno ha esperienza di fill in con la klenow della promega e puo darmi qualche dritta?
grazie
|
|
|
|
|
Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2010 : 17:04:37
|
banale,
segui il protocollo che ti danno, non aspettarti miracoli (tipo efficienza del 100%)
e ricordati di disattivarla ;-)
tutto qui
 |
 |
|
|
mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2010 : 17:17:29
|
me ne hann dato uno che mi ha funzionato ..ma ora ho controllato il protocollo originale promega e ho visto che e diverso da quello che avevo usato...
siccome adesso il mio vettore e una bestia di 9400 bp..non saprei |
|
|
|
mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2010 : 17:26:23
|
[qualche dritta per un clonaggio sticky-blunt?
Dovrei x il vettore (9500 bp)
a)digerire con un enzima sticky
b)purificare
c)klenow
d)purificare
e)altro enzima sticky (nn posso usarli insieme xk mi serve solo un estremita blunt)
d)purificare
|
|
|
|
Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2010 : 21:00:57
|
in sintesi:
1) purifichi davvero un sacco, quindi devi partire da una bella quantità di DNA iniziale
2) la klenow vuole un sacco di dNTP, metticene a volontà altrimenti mangia invece di polimerizzare
3) anche il rapporto concentrazione di DNA/klenow è importante, verifica sulle istruzioni
4) generalmente 15 minuti bastano per fare quelle 3-4 basi che servono, non di più
5) invece della purifiazione su gel potresti fare la fenolo/cloroformio + precipitazione in alcool, oppure disattivi con la temperatura gli enzimi, man mano
6) attenzione a non esagerare con la quantità di enzima, generalmente la somma degli enzimi in glicerolo non deve superare il 10% del volume totale della reazione.
7) attenzione ai tagli crociati, usa la BSA
8) cerca di lavorare pulitissima poiché la reazione di fill in è alquanto poco efficiente, diciamo sul 50% o poco più, e la ligasi di una blunt è ancora meno efficiente, fatti tu il calcolo.
Se ti rimane qualcosina di stiky o non tagli bene il vettore si richiude su se stesso ed hai un bel po' di background di colonie inutili.
9) sei al limite di un vettore ad high copy, quindi qualsiasi schifezza che sia <9.000 bp avrà una certa facilità di formare colonie.
lavora pulito, non arronzare e soprattutto insisti un po'
in bocca al lupo
|
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2010 : 21:33:06
|
1)direi di partire con una quantità tra 5-10 ug.
2)se le estremità sono 5' overhang non ti preoccupare dell'attività esonucleasica, semplicemente nn sussiste (tra l'altro l'attività 3'->5' esonucleasica della klenow fa comunque cagare, a differenza della polimerasica che è piuttosto efficiente).
3)io come quantità di dNTPs uso uno stock 2mM, 4 ul in un volume finale di 80 ul (100 uM tot),
4)per quanto riguarda tempo e T,io faccio 15-20 minuti a 12 °C.
5)la klenow puoi inattivarla per 10 min a 75°C, ma se purifichi è facoltativo.
6)ti consiglio la purificazione da gel, quantomeno dopo la o le digestioni, perchè in questo modo purifichi la specifica banda che interessa a te. Inoltre, visto che tagli con due enzimi diversi e che ti rimuovi un bel pezzetto di DNA, in questo modo sei sicura di purificare il backbone completamente digerito.
|
 |
|
|
|
mo-lab
Utente Junior
Città: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2010 : 21:40:57
|
| thanks |
|
|
| |
Discussione |
|
fill in
Didattica
