Costruzione di ceppi di lievito produttori della glucoamilas

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Sun89
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Inserito il - 10 giugno 2010 : 11:36:22

Esperienza � Costruzione di ceppi di lievito (kluyveromyces lactis) produttori dell'enzima glucoamilasi

PROTOCOLLO SPERIMENTALE PER LA TRASFORMAZIONE DI LIEVITO

misurare l' assorbanza a 600 nm, la densit� ottica deve essere compresa tra 0.5-0.6.
Versare negli appositi tubi da centrifuga 50ml di coltura.
Centrifugare per 5-10 minuti a 5000 giri a temperatura ambiente .
Eliminare il surnatante e lavare le cellule risospendendole in 10 ml di TE (1M, ph8).
Centrifugare per 5-10 minuti (5000giri a t ambiente) ed eliminare il surnatante .
Risospendere il pellet cellulare in 0.25 ml di TE e 0.25 ml di LiCl (0.2M).
Incubare le eppendorf per 20-30 minuti a 28�C.
Prelevare 0.1 ml di cellule per ogni trasformazione e mettere in una nuova eppendorf .
A 0.1 ml di cellule aggiungere : 0.006 ml di DNA carrier (10 mg/ml) e 0.001 mg di DNA plasmidico (pTS32x-GAA e pUKS11). In parallelo si deve fare un protocollo negativo (- DNA).
Incubare per 10 minuti a 28�C.
Aggiungere 0.8 ml di PEG 4000 (40 %).
Incubare per 10 minuti a 28�C.
Aggiungere 0.090 ml di DMSO (DiMetilSolfOssido).
Mettere a 42�C per 10 minuti .
Centrifugare per 1 minuto ed eliminare il surnatante .
Risospendere il pellet in 1ml di acqua bidistillata .
Centrifugare per 30 secondi ed eliminare il surnatante .
Risospendere in 0.150 ml di acqua bidistillata e piastrare su terreno selettivo utilizzando le palline di vetro per una distribuzione uniforme sull' intera piastra.
Lasciare le piastre per 3-4 giorni a crescere alla temperatura di 28�C .Le colonie crescenti su terreno selettivo devono essere recuperate e ulteriormente verificato il loro fenotipo Ura+ , cio� ci si deve assicurare che la crescita su terreno privo di uracile sia associata alla presenza del plasmide e non sia dovuta ad una reversione al locus ura3.

PROTOCOLLO SPERIMENTALE PER LA DETERMINAZIONE IN PIASTRA DELLA GLUCOAMILASI

Diluire in modo opportuno le colture dei diversi trasformanti per effettuare degli spot su piastre di amido al 2%. Ogni spot deve avere un volume di 0.010 ml e contenere circa 10000 cellule .
Incubare le piastre per almeno 4 giorni a 28�C per permettere la crescita .
Versare nelle piastre 4.5 ml di Liquido di Lugol , lasciare agire per qualche minuto quindi versare l' eccesso di liquido .

Mi farebbe piacere ricevere delle risposte alle seguenti domande che riguardano questa esperienza di laboratorio.

DOMANDE
1.Prima di iniziare la trasformazione avete misurato l' assorbanza (OD600) delle colture. Perch�?
2.Hai effettuato la trasformazione dei due ceppi di lievito utilizzando un vettore contenente il gene che codifica per la glucoamilasi (pTS32X-GAA) e un vettore di controllo (pUKS11), Su quale tipo di terreno hai selezionato i trasformanti ? E perch�?
3.Quanti trasformanti hai ottenuto ? Calcola l' efficienza di trasformazione di ciascun ceppo e se non � possibile fai alcune considerazione.
4.Per gli spot dei cloni trasformati sono state utilizzate piastre contenenti amido come fonte di carbonio. Quali cloni ti aspetti che crescano in presenza di tale fonte di carbonio ? Cosa osservi invece e perch�?
5.Spiega il principio del liquido di Lugol impiegato per il saggio in piastra della glucoamilasi . A cosa serva tale saggio? Hai osservato delle differenze tra i ceppi spottati?
6.Diluire in modo opportuno una coltura a concentrazione 2x1000000000 per spottare su piastra 0.005ml di coltura contenenti 100000 cellule.

Scusate la lunghezza del post... Spero riusciate a risolvere i miei dubbi.
In attesa di una vostra risposta vi ringrazio.