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Autore Discussione  

mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi
Inserito il - 21 luglio 2010 : 11:09:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti..e’ circa un mese che provo a fare uno stupidissimo clonaggio:
Plasmide tagliato con cla (per forza solo quello) pcr idem..ma nulla..pensando fosse un problema di digestione questo we ho provato a fare un topo cloning che e’ venuto perfetto ..ho fatto la digestione con cla per avere l insert ho scoperto che dopo un over night il mio topo plasmid era solo linearizzato..ma com e’ possibile?
Inoltre avendo questo polilinker: eco cla pcr cla eco ho tagliato con eco e la digestion e’ venuta perfetta..
Qualcuno mi ha suggerito un problema di metilazione…ma solo un sito cla?
Boh…

Idée??

PS:ho controllato I primers..a ogni modo domani sequenzio..
sgrunt

Neuroscience
Utente



659 Messaggi
Inserito il - 21 luglio 2010 : 13:34:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
l'enzima Cla effettivamente non può tagliare la sequenza ATCGATC quando è metilata sulla G
ed anche la sequenza ATCGAT se ci sono Overlapping CpG.

L'unica possibilità è fare una maxiprep da batteri che sono metilasi negative. In questo modo risolveresti subito senza cambiare enzima o sequenza.

In bocca al lupo.
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi
Inserito il - 26 luglio 2010 : 12:25:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cosa pensi di queste cellule c2992h della neb?
vanno bene?
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi
Inserito il - 26 luglio 2010 : 13:30:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Genotype: FL proA+B+ lacIq #8710;(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) / fhuA2#8710;(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 ƒ³80ƒ¢(lacZ)M15 gyrA96 recA1 endA1 thi-1 hsdR17
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mo-lab
Utente Junior

Città: utrecht


348 Messaggi
Inserito il - 04 agosto 2010 : 14:00:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mo-lab Invia a mo-lab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cambiando cellule ha funzionato!
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