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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
 Inserito il - 18 agosto 2010 : 11:46:56
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Ciao a tutti!
Vorrei sapere se qualcuno di voi sa che tipo di esperimenti o analisi devono essere effettuate per dimostrare di avere un nuovo isotipo di un gene.
Mi spiego meglio:
da una pcr su di un tessuto ho ottenuto il mio gene d'interesse (la sequenza corrisponde a quella pubblicata nei database) e un altro gene che differisce dal primo di circa 20 nucleotidi (ne ha 20 in meno).
cosa devo fare per capire se è un isotipo diverso (dovuto magari a splicing alternativo)?
in letteratura si parla di isoforme diverse dalla proteina, ma nessuno riporta la sequenza amminoacidica nè quella nucleotidica.
Ho già inviato un messaggio nel forum di bioinfo, qualche tempo fa, ma nonostante il vostro prezioso aiuto non sono riuscita a "cavare un ragno dal buco"...
AIUTO!!!!!
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giulella
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 18 agosto 2010 : 12:13:35
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Ciao,
penso che per dimostrare che si tratta di una diversa isoforma della tua proteina debba estrarre il DNA dalla banda che ottieni dopo PCR, clonarlo (se necessario) e mandarlo a sequenziare. una volta ottenuta la sequenza avrai la certezza di cosa si tratti...se è una diversa isoforma dovresti avere la presenza di qualche introne che è assente dall'altra.
Dopo aver avuto la conferma a livello nucleotidico dovresti pero' dimostrare la presenza dell'isoforma anche a livello proteico. Esistono casi in cui l'RNA di alcune isoforme viene degradato e non tradotto...
Spero di esserti stata d'aiuto :) |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 18 agosto 2010 : 12:32:53
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Grazie, sei molto gentile ad aver risposto...
purtroppo ho già fatto tutto quello che mi hai detto.
E' un pezzo di esone che viene tagliato via...
ma come dimostro che è un isotipo?
potrebbe essere un "mostro" creato dalla pcr?!
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giulella
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 18 agosto 2010 : 14:21:15
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Bè innanzitutto potresti controllare se l'esone possiede al suo interno le sequenze consenso per lo splicing...ossia se c'è un sito alternativo di splicing all'etremità 3' e 5' dell'esone (dipende da quale parte dell'esone è tagliata).
Poi, come ho già scritto, dovresti ricercare anche la proteina. Controlla quali sono le consequenze a livello amminoacidico quando manca parte dell'esone (frame shift, prematuro stop-codon), cosi' ti puoi fare un'idea della dimensione della proteina. |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 19 agosto 2010 : 11:00:43
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Controllerò i siti alternativi di splicing.
La proteina che vien fuori ha 40 amminoacidi in meno (mi ero sbagliata: 120 nt in meno!!!
Ma credo di essere un po' stupida: non riesco comunque a capire come faccio a dimostrare che è un isotipo...
Ho anche trovato un bioinfo tool molto carino, ASPicDB, ma non ho ben capito delle cose.
Magari proverò a sentire se c'è qualcuno nell'altro forum che può aiutarmi per questa parte.
Grazie ancora.  |
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