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malli
Nuovo Arrivato
Prov.: treviso
Città: TREVISO
4 Messaggi |
 Inserito il - 01 settembre 2006 : 16:21:11
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Ciao,
qualcuno di voi mi sa dire come faccio a trasformare un valore di assorbanza a 260 nm (associato ad un prodotto di PCR) in un numero di copie di questo stesso prodotto. Dovrebbe esistere una formula matematica.... Grazie
PCRissima in difficoltà
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2006 : 23:43:13
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| Non credo sia così semplice, che io sappia il numero di copie lo puoi determinare con realtime o con PCR competitiva.... dall'assorbanza puoi ottenere la concentrazione... non so però, magari mi sbaglio, non disperare! |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 03 settembre 2006 : 19:26:19
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 Il numero di copie di un campione lo puoi determinare, a quanto ne so io, se coamplifichi uno standard. In questo caso esiste una formula che ti permette di calcolare il numero di copie finale ed è la seguente:
N°copie finale=(DO campione*fattore di diluizione*N°copie standard iniziale)/(DO standard*fattore di diluizione). Personalmente altre formule non ne conosco. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2006 : 11:39:15
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Non vorrei dire stupidaggini ma secondo me è possibile!
Dal valore di assorbanza ricavi la concentrazione, e fino a qua non ci dovrebbero essere problemi.
Poi sapendo la lunghezza del tuo amplificato puoi calcolarne il peso e dividendo la concentrazione per il peso ottenere il numero di copie... mi spego con un esempio:
ad es. hai una concentrazione di 150 ng/ul e hai fatto la reazione di PCR in 20ul quindi in totale hai:
150 ng/ul x 20ul = 3000ng di prodotto
sapendo che una coppia di basi pesa in media 660fg (fg = femtogrammi, 1 fg = 10(-6) ng) e ad esempio il tuo amplificato è di 300bp, risulta che il peso di ogni singola copia è:
660fg x 300 = 198000fg = 0,198ng (appossimando 0,2ng)
a questo punto se divido il peso totale del mio prodotto per il peso di una singola copia ottengo il numero di copie:
3000ng : 0,2ng = 15000 copie
Non so però quanto sia accurato questo calcolo visto che contiene molte approssimazioni e inoltre nel valore di assorbanza del tuo campione dovresti tener presente che nella provetta non hai solo amplificato ma primers non incorporati, dNTPs, stampo iniziale...
 Correggetemi se sbaglio!!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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malli
Nuovo Arrivato
Prov.: treviso
Città: TREVISO
4 Messaggi |
Inserito il - 05 settembre 2006 : 17:57:04
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Grazie a tutti,
volevo dire a GFPina che sono sulla buona strada: ho paura che manchi ancora qualcosa alla formula perchè si ottengono troppe poche copie di prodotto(che è già purificato dai nucleotidi liberi e dal templato) da una tale assorbanza.
Mi servono almeno 10E+6 copie per fare il primo punto di una curva standard da utilizzare in real time. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 settembre 2006 : 15:37:18
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Ok ce l'ho fatta!!!  
In effetti non è facile da trovare la formula... il mio ragionamento era quasi giusto, quello che manca è il numero di Avogadro!!! Necessario per passare dalle moli al numero di copie!!!
Questa è l'equazione:
Citazione:
The following equation was used to calculate the copy numbers from a known PCR product concentration: weight of PCR fragment (in grams per microliter)/(660 g per mol × the number of base pairs of the PCR fragment) × (6.023 × 10(23)) = the number of genomic copies per microliter.
trovata da questo articolo:
Malorny B, Hoorfar J, Bunge C, Helmuth R.
Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards an international standard.
Appl Environ Microbiol. 2003 Jan;69(1):290-6.
PMID: 12514007 [PubMed - indexed for MEDLINE]
http://pubmedcentral.gov/articlerender.fcgi?artid=152403
Questa è la definizione del numero di Avogadro da Wikipedia:
http://it.wikipedia.org/wiki/Numero_di_Avogadro
Ciao!!! |
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kià
Nuovo Arrivato
Prov.: Padova
Città: padova
8 Messaggi |
Inserito il - 06 settembre 2006 : 17:49:46
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GFPina sei grande!!!!!!
ora posso cominciare a dosare i miei geni in modo assoluto
grazieeeeeeee |
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malli
Nuovo Arrivato
Prov.: treviso
Città: TREVISO
4 Messaggi |
Inserito il - 06 settembre 2006 : 17:58:31
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GFPina sei grande
ora posso dosare i miei geni in modo assoluto
Grazieeeee.......
(ps mi sono accorta di aver scritto utilizzando la connessione aperta di una collega
grazie ancora
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Discussione |
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numero di copie di un prodotto di PCR
Didattica
