Primers mutagenici per PCR

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CRLM
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20 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 12:18:34

Buongiorno!!!!
Qualcuno potrebbe provare a spiegarmi come sintetizzare(ovvero scrivere a mano) primer mutagenici per PCR?

Questo � un es. di una prova d'esame:
Scrivere le sequenze di due oligonucleotidi mutagenici per la sostituzione tramite PCR della leu in ser
(TCG) nella sequenza

5�ACG ATC TTT GGC GAG CTG GCG GGC AGC 3�
  thr ile phe gly glu leu ala gly ser

interna ad un gene clonato
Ringrazio gi� chi prover� a rispondermi

adrez
Nuovo Arrivato

10 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 15:20:09

5'-------------acg-atc-ttt-ggc-gag-CTG-gcg-ggc-agc---------------3'
3'-------------tgc-tag-aaa-ccg-ctc-GAC-cgc-ccg-tcg---------------5'

questa � la sequenza del gene sulla quale devi costruire i 2 primer per la sostituzione della leu(CTG) in ser(TCG).

5'-------------acg-atc-ttt-ggc-gag-CTG-gcg-ggc-agc---------------3'
            3'-tgc-tag-aaa-ccg-ctc-AGC-cgc-ccg-tcg-5'

            5'-acg-atc-ttt-ggc-gag-TCG-gcg-ggc-agc-3'
3'-------------tgc-tag-aaa-ccg-ctc-GAC-cgc-ccg-tcg---------------5'

I due primer sono:


1)5'-acg-atc-ttt-ggc-gag-TCG-gcg-ggc-agc-3'
2)3'-tgc-tag-aaa-ccg-ctc-AGC-cgc-ccg-tcg-5'

CRLM
Nuovo Arrivato

20 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 15:38:48

cio� scrivo l'elica complementare, mi riscrivo le due eliche con la tripletta codificante LEU gi� mutata in modo che poi codifichi per SER e sintetizzo i primers complementari?senza calcolare temperatura di annealing n� nient'altro?!

grazie mille!!!

adrez
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10 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 16:00:28

1)cio� scrivo l'elica complementare, mi riscrivo le due eliche con la tripletta codificante LEU gi� mutata in modo che poi codifichi per SER e sintetizzo i primers complementari? esatto!

2)senza calcolare temperatura di annealing n� nient'altro?!la temperatura di annealing non ti serve per determinare la sequenza dei primer. I primer non vengono disegnati in funzione della temperatura di annealing. Di solito queste pcr vengono condotte in condizioni di bassa stringeneza in modo da favorire il legame di primer non perfettamente complementari alla sequenza bersaglio
-se non ti � chiara qualcosa chiedi pure-

CRLM
Nuovo Arrivato

20 Messaggi

Inserito il - 30 agosto 2010 : 16:05:12

Citazione:
Messaggio inserito da adrez
[-se non ti � chiara qualcosa chiedi pure-

no no, ho capito bene grazie!
finalmente!!!!!!!!!
sei stato di grande aiuto!!!

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 31 agosto 2010 : 11:43:29

Nota: Ho modificato i messaggi per renderli pi� chiari (e quindi cancellato i doppioni) , se volete fare in modo che il testo che scrivete rimanga allineato utilizzate il tag code:
[code ]...[/code]
quello che viene scritto in mezzo rimane allieato come lo avete scritto.

Qua trovate l'elenco dei tag disponibili: http://www.molecularlab.it/forum/faq.asp#format

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