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molly88
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4 Messaggi |
 Inserito il - 30 agosto 2010 : 23:23:22
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ciao a tutti vorrei chiedervi un parere riguardo una domanda dell'esame di metodologie biochimiche:
una proteina dopo la purificazione dà 2 bande su SDS-PAGE.Quali diverse interpretazioni potete dare? quali esperimenti potete fare per distinguere tra le diverse ipotesi?
ho l'esame venerdì...
grazie mille in anticipo
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 31 agosto 2010 : 09:44:02
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| potrebbe essere un contaminante che ti porti dietro purificando, o una proteina associata che non si stacca durante la purificazione o, più banalmente, una degradazione e quindi vedi più di una banda. tu che esperimenti faresti per capire di cosa si tratta? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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molly88
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 11:06:33
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dunque.. ..se si è trattato di un contaminante, rifarei la purificazione + SDS-PAGE per vedere se ho nuovamente 2 bande..oppure farei un western blot in modo da capire quale delle 2 bande è la mia proteina.. no?
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CRLM
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 11:08:50
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se è un contaminante lo posso vedere ricaricando la soluzione su cromatografia reverse phase in condizioni denaturanti (es.acetonitrile) e poi rifare SDS, no?
cmq la spiegazione nn può essere che sia eterodimerica o abbia in parte subìto degradazione proteolitica o modificazione post-traduzionale? |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 13:04:39
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certo, questa è un'ipotesi. in quel caso vedi qual è il PM delle diverse bande vs il PM della proteina intatta. se è un contaminante puoi provare a cambiare un po' le condizioni di purificazione ma non è detto che funzioni.
l'anticorpo ti riconosce più bande, quindi può voler dire due cose, a mio parere: 1) l'anticorpo non è molto specifico e ti riconosce anche altre proteine oltre alla tua. 2) le bande che vedi sono proteine che hanno lo stesso epitopo.
per le modificazioni post-traduzionali, le vedresti solo nel caso in cui usassi un sistema diverso da quello batterico per produrre la proteina. non credo sia il caso di addentrarsi, però è una possiiblità.
secondo me la proteina si degrada. |
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CRLM
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
 Inserito il - 31 agosto 2010 : 14:20:55
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ok!!!grazie mille!!!!!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 15:00:01
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| Beh aggiungerei che possono anche essere due diverse isoforme della stessa proteina. |
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CRLM
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 15:51:37
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ovvero la stessa proteina codificata da due geni diversi, perciò con due sequenze leggermente differenti che influiscono sul PM? |
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CRLM
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 16:03:20
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colgo l'occasione per chiedere a GFPina se non conosce qualche link a siti che propongono quesiti di metodologie biochimiche e biomolecolari(ho visto i numerosi link di genetica che ha postato)!
grazie anticipatamente |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 16:07:55
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Beh aggiungerei che possono anche essere due diverse isoforme della stessa proteina.
dici? non ne sono sicurissima, perchè modificazioni tipo glicosilazione o altre non le vedi in un sistema batterico. allora mi sono domandata se possa avvenire splicing alternativo su un plasmide... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 16:22:40
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Citazione:
Messaggio inserito da Iside
dici? non ne sono sicurissima, perchè modificazioni tipo glicosilazione o altre non le vedi in un sistema batterico. allora mi sono domandata se possa avvenire splicing alternativo su un plasmide...
Scusa Iside, mi ero già posta questa domanda al tuo intervento precedente, ma poi ho pensato la tua fosse solo una precisazione: ma "dove hai letto che si tratta di un sistema batterico?"
nella domanda iniziale non è specificato!
Citazione:
Messaggio inserito da CRLM
ovvero la stessa proteina codificata da due geni diversi, perciò con due sequenze leggermente differenti che influiscono sul PM?
No, io intendevo isoforme in senso più ampio: diverse forme della stessa proteina
possono essere codificate dallo stesso gene, ma subire splicing alternativo, modificazioni post-traduzionali... ecc.
Un esempio potrebbe anche essere che hai 2 alleli dello stesso gene che codificano per la stessa proteina ma uno è normale e l'altro invece è mutato e produce una proteina tronca, quindi avrai 2 bande con peso molecolare diverso.
Insomma le possibilità sono molte.
Riguardo ai links con quesiti di metodologie biochimiche e biomolecolari, mi spiace ma non ne conosco. Quelli di genetica sono frutto di una lunga ricerca e di indicazioni di altri utenti, in effetti però potrebbe essere interessante cercarli anche per queste materie, vedremo cosa fare!  |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 17:09:09
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Scusa Iside, mi ero già posta questa domanda al tuo intervento precedente, ma poi ho pensato la tua fosse solo una precisazione: ma "dove hai letto che si tratta di un sistema batterico?"
nella domanda iniziale non è specificato!
no questo in effetti non è specificato. E' stata solo una mia supposizione data la domanda didattica più che pratica. L'ho voluto specificare perchè credo sia una cosa importante da ricordare, soprattuto per un esame |
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CRLM
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 20:15:09
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grazie ugualmente GFPina!!
immagino il lungo lavoro che sta alle spalle...!!!!
era pura curiosità! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2010 : 21:52:14
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@ iside: sì, però dalla domanda iniziale io non darei per scontato che si tratti di proteine eterologhe espresse in batteri, anche se plausibile.
@ CRLM: beh se trovo qualche link te lo indico, poi magari con calma faro un post simile anche per Biologia Molecolare.
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domanda esame SDS-PAGE
Didattica
