|
Carla83
Nuovo Arrivato
19 Messaggi |
 Inserito il - 06 settembre 2010 : 17:09:30
|
Ciao a tutti, io sto cercando di clonare un inserto di 2kb all'interno di un vettore di poco più di 6kb (pSPL3), ma ho avuto non pochi problemi...riassumo brevemente: ho amplificato il frammento da clonare dal DNA genomico, ho digerito sia il plasmide che il frammento con doppia digestione (XbaI e NheI), fatta ligazione, trasformazione e cresciute parecchie colonie. Ho fatto lo screening delle colonie con la PCR, e praticamente non ho trovato colonie positive....vabbè mi son detta, magari la PCR non è andata bene; ripeto PCR con altri primers e trovo qualche colonia positiva, faccio miniprep delle colonie positive e cerco di sequenziare per verificare se l'inserto è clonato bene e niente, le sequenze non vengono mai (ho aumentato i ng di plasmide, ho aumentato la big dye, ho cambiato primer ma nulla di nulla). A questo punto ho deciso di fare un altro controllo: digerisco miniprep e plasmide di partenza vuoto con un enzima, per linearizzare il plasmide e vedere a che altezza ritrovo la banda. Controllo su gel e incubo , mille bande: il vettore di partenza ne ha due, una sarà sicuramente quella del vettore non digerito, l'altra però corrisponde alla banda del ladder 10kb! idem per le miniprep....vi chiedo: cosa può essere successo??? è possibile che ci siano stati problemi nella migrazione del gel??? 
|
|
clonaggio
Didattica
