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Vars
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
 Inserito il - 15 settembre 2010 : 18:48:39
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Ciao...vorrei chiedere una cosa...potreste spiegarmi perchè in un esperimento di clonaggio genico è preferibile usare enzimi di restrizione che tagliano blunt o che tagliano sticky, quali sono i vantaggi e gli svamtaggi di usare uno o l'altro tipo. E poi vorrei sapere come si rapporta la risoluzione di problemi derivanti dall'uso dell'uno o dell'altro tipo di enzima con la tecnica del fill in, questa è stata una domanda che ho sentito posta ad un esame, quind probabilmente ho capito male io, ma comunque sono sicura che nel discorso sugli enzimi di restrizione si sia parlato di fill in, qual è la relazione?
grazie in anticipo!
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Fujiko1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Varese
8 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2010 : 19:05:38
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| ciao!! Una proprietà importante delle estremità coesive è che quelle prodotte dallo stesso enzima, anche su molecole diverse, sono complementari ( o sticky cioè appiccicose) e quindi in grado di appaiarsi l'una con l'altra. Ciò significa che un enzima di restrizione usato su un plasmide e su un frammento di Dna genera estremità complementari che possono essere unite da una ligasi a formare un vettore che potrà poi essere clonato! |
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Fujiko1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Varese
8 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2010 : 19:06:38
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| sinceramente la tecnica del fill in non so cosa sia!! ciaoooooo |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2010 : 19:25:48
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il fill-in consiste nell'impiego di una polimerasi (generalmente la T4 polimerasi o la klenow) per "riempire" il tratto a filamento singolo di DNA lasciato da une enzima di restrizione 5' overhang (cioè che lascia estremità 5' sporgenti). Se ora metti la polimerasi, essa risintetizza il pezzetto di filamento sottostante mancante, generando estremità piatte (o blunt).
Es:
5'TAAT 3'
(HO)TA 5' ----->
(T4pol)
5'TAAT 3'
3'ATTA 5'
Questo è molto utile quando vuoi clonare un determinato inserto, in un determinato vettore, e non puoi utilizzare enzimi che generano estremità coesive uguali (o meglio complementari) o enzimi che generano direttamente estremità piatte.
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Vars
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2010 : 20:05:50
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| spemmanorganizer grazie per la risposta! ma è possibile usare questa tecnina per prevenire la formazion di molecole aberranti che possono derivare da tagli con enzimi blunt? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2010 : 21:09:40
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| cosa intendi per molecole aberranti? |
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Vars
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2010 : 21:33:51
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quelle che si richiudono su se stesse, oppure che sono state inserite nella direzione sbagliata o che si associano in tandem testa coda...questo tipo di molecole si generano più facilmente se si usano enzimi blunt? perchè anche tagliando con enzimi diversi, possono lo stesso assemblarsi tra di loro...invece se riempio le estremità cn il fill in in modo da creare estremità stick non complementari, così che il mio dna possa inserirsi nel vettore scelto e nella direzione giusta, posso evitare la formazione di qst molecole nn desiderate?
nn so se qst mia ipotesi sia giusta, potrei aver detto delle cose che nn hanno senso, correggimi se sbaglio! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2010 : 21:42:29
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no, credo che tu abbia fatto un pò di confusione. E' proprio con gli enzimi blunt e con il fill-in che c'è il rischio di richiudere il vettore su se stesso (ricircolarizzazione). Lo stesso può succedere usando enzimi di restrizione che generano estremità sticky uguali. Questo spiacevole inconveniente può essere evitato, o quantomeno ridotto, con l'uso di fosfatasi alcalina.
Invece usando enzimi che generano estremità diverse, non essendo queste complementari,non potrai avere ricircolarizzazione del vettore su se stesso.
Chiaro?
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Vars
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2010 : 22:26:13
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| sisi il fatto che il rischio che la molecola rischi di richiudersi su se stessa usando enzimi blunt o gli stessi enzimi sticky mi era chiaro, forse nn m sn espressa bene prima...non mi era chiaro se è possibile usare la tecnica del fill in per aggiungre estremità non complementari...però dalla tua spiegazione evinco il contrario e quindi credo che non si possa fare, perchè tu stesso/a hai detto che questa tecnica si usa proprio quando non ho enzimi blunt o quando genero estremità coesive non complementari..grazie per la disponibilità! |
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