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Moloney
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 Inserito il - 21 settembre 2010 : 11:45:33
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Usando un inibitore delle HDAC, osservate l' up-regolazione di un gene.
Fate una ChIP usando un Ab vs istone-acet e PCR (quantitativa o semiquantitativa) con primers per siti regolatori (promotore, ad esempio): vedete che nel campione trattato avete una banda più intensa rispetto al campione non trattato. Quindi il sito che avete amplificato è più acetilato.
Secondo voi è una prova DIRETTA che l' inibitore ha funzionato direttamente sul gene? Se non lo è (spiegate il perchè), che prova diretta suggerireste?
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_pietro_
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Città: Lund
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Inserito il - 21 settembre 2010 : 13:52:57
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Ciao,
anch'io lavoro un po' su HDAC. Direi che la tua strategia e' ottima, ma piuttosto costosa se non sbaglio.
Per prima cosa direi che non so se l'inibitore agisce su un gene in particolare, l'inibitore (quale usi?) reprime l'attivita' delle HDACs quindi favorisce una maggiore acetilazione degli istoni e di certe proteine (come saprai, le HDACs non deacetilano solo gli istoni). Il risultato di cio' e' una cromatina piu' rilassata quindi piu' prona alla trascrizione. Tranne questa sottigliezza forse inutile, direi che il tuo ragionamento fila.
Ad ogno modo, se hai la possibilita' di seguire qualche output in WB e IF per epitopi acetilati (come istoni, lisine acetilate) fallo.
Noi qui si e' recentemente pubblicato un paper su questi argomenti... se vuoi ti passo il link |
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Moloney
Nuovo Arrivato
111 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2010 : 14:17:07
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Accetto volentieri il link.
In realtà io non controllo solo un gene, ma è un gene saltato fuori da un array come up-regolato. Quello che mi chiedo è: ma se un gene è indotto, anche con molecole NON inibitori di HDACs, non è ovvio che i suoi siti regolatori siano più acetilati (in seguito all' induzione)?
Esempio: tratto le mie cellule con la tale vitamina che so indurre il gene X. Dopo il trattamento i siti regolatori di questo gene saranno comunque più acetilati, rispetto al controllo non trattato, no?
Parallelamente, l' inibitore (è il valproato) potrebbe indurre l' espressione primaria di geni che poi vanno ad aprire la cromatina nel mio gene di interesse reclutando HATs: quindi non so, ma per me la ChIP alla fine non è sinonimo che l' inibitore ha effettivamente inibito, il VA potrebbe aver agito attraverso altre pathways e il risultato sarebbe comunque l' acetilazione... no? |
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_pietro_
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Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2010 : 14:46:53
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Ecco il link:
http://www.nature.com/cddis/journal/v1/n2/abs/cddis20104a.html
sono d'accordo con te, ma il tuo obbiettivo e' l'output, cioe' l'espressione del gene o l'inibizione in se' stessa delle HDACs (che sono molteplici e il valproato non le inibisce tutte)?
Il ChIP ti dice quali sequenze un fattore di trascrizione lega: piuttosto che usare un anticorpo contro Ac. Hist., che mi pare molto generale, non ne puoi usare uno per un fattore di trascrizione che sai agire come attivatore della trascrizione del tuo gene? Come alternativa...
Un altra cosa che puoi' fare e' un saggio enzimatico per le HDACs e le Sirtuins, il che puo' essere costoso, ma potresti avere buone possibilita' di distinguere tra HDACs di classe I e II e quelle di classe III.
Io al momento sto facendo studi sulla metilazione del DNA, sto usando degli inibitori delle DNA metil transferasi con discreti risultati, ma non riesco ancora a capire se mi inibisce l'enzima o agisce per vie traverse... siamo sulla stessa barca 
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Moloney
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111 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2010 : 00:40:38
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Citazione:
Messaggio inserito da _pietro_
Ecco il link:
http://www.nature.com/cddis/journal/v1/n2/abs/cddis20104a.html
sono d'accordo con te, ma il tuo obbiettivo e' l'output, cioe' l'espressione del gene o l'inibizione in se' stessa delle HDACs (che sono molteplici e il valproato non le inibisce tutte)?
Il ChIP ti dice quali sequenze un fattore di trascrizione lega: piuttosto che usare un anticorpo contro Ac. Hist., che mi pare molto generale, non ne puoi usare uno per un fattore di trascrizione che sai agire come attivatore della trascrizione del tuo gene? Come alternativa...
Un altra cosa che puoi' fare e' un saggio enzimatico per le HDACs e le Sirtuins, il che puo' essere costoso, ma potresti avere buone possibilita' di distinguere tra HDACs di classe I e II e quelle di classe III.
Io al momento sto facendo studi sulla metilazione del DNA, sto usando degli inibitori delle DNA metil transferasi con discreti risultati, ma non riesco ancora a capire se mi inibisce l'enzima o agisce per vie traverse... siamo sulla stessa barca
Il mio obiettivo sarebbe dimostrare che il meccanismo molecolare attraverso cui il VA agisce modulando quel tale gene passa per l' inibizione delle HDACs, quindi non mi serve fare una ChIP per un TF.
Mi potresti spiegare "in breve" il saggio di cui parli? Ti fotografa la situazione "in vivo" cellulare o è una forzatura "in vitro" (per in vitro intendo cose come il gel shift, dove schiaffi dentro all' eppendorf i componenti della reazione, mentre la ChIP la possiamo considerare in vivo perchè si guarda la situazione endogena cellulare)? Se mi spiegassi un attimo sarei molto contento :D
Comunque Cell Death and Differentiation è la nuova rivista, vero? Si dice che avrà un IF di circa 5 in pochi anni, buona scelta!
PS: anche io ho usato degli inibitori di DNA metiltrasferasi, la 5aza... Provai anche l' RG108, ma faceva piuttosto schifo |
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_pietro_
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Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2010 : 09:58:21
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Cell death and disease e' la nuova rivista online. E' la rivista sorella di Cell death and differentiation, per cui teoricamente l'impact factor dovrebbe essere lo stesso (7,qualcosa) ma senz'altro non sara' cosi' e il valore sara' piu' simile a quello che dici tu. Fattosta che non l'abbiamo inviato a CDD :)
Il saggio enzimatico che abbiamo usato era un saggio tipo colorimetrico on plate, ma e' stato adattato e usato in sezioni in IF. Sul paper ci sono i dettagli, ma non l'ho fatto personalmente io, che mi sono occupato di un'altra parte.
Cosa intendi con metodi diretti in vivo?
Spiegami un attimo il tuo sistema: su che modello lavori e quali tessuti o cellule usi, come applichi il VA ecc.. Si possono usare una serie di metodi, pensandoci sopra, che magari non ti danno la prova di quello che cerchi, ma che ti mettono in serie tante piccole evidenze che la tua teoria e' giusta. Molto dipende anche dal budget...
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Moloney
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111 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2010 : 12:23:38
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Ho avuto un' ispirazione, catalizzata dalla lettura dei giusti papers!
Per dimostrare che VA up-regoli l' espressione del gene X attraverso un' inibizione delle HDACs:
1)si può fare un grafico di correlazione tra l' aumento dell' acetilazione del promotore ( ChIP + qPCR) all' aumento della trascrizione
2)Si possono prendere analoghi del VA a IC50 crescente (quindi sempre meno potenti) e dimostrare che l' induzione del tale gene è dipendente dall' IC50.
La correlazione sarebbe fra HDAC inhibition in vitro, acetilazione in vivo, attivazione della trascrizione, induzione dell' effetto biologico (nel mio caso differenziamento).
La seconda mi convince più della prima, perchè mi pare proprio la prova "formale". Il primo punto mi sembra un saggio elegante, ma che dimostra?
Tu che dici, Pietro? |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2010 : 14:50:43
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Il punto uno ti potrebbe dire che all'aumentare dell'acetilazione del promotore ti aumenta la trascrizione per quel gene, non mi sembra male, anzi e' quello che ti prefiggi apparentemente. E' vero che potrebbero esserci altri fattori, ma a me sarebbe sufficiente.
Io seguirei il destino di quel trascritto. Il Northern blot non e' necessario, visto che l'mRNA lo estrai per la qPCR. Se hai la possibilita' io fare anche un IF per vedere direttamente in situ se la tua proteina e' maggiormente espressa e un western, confrontando controllo e trattato.
Pensavo al saggio enzimatico. Non ti serve. A che serve sapere quanto il valproato ti inibisce la HDAC? E' gia' noto no?
Potresti anche silenziare l'espressione delle diverse HDACs con una strategia di miRNA per vedere chi e' il principale sottotipo a indurti l'effetto sperato.
Il punto 2 suona quasi un follow up, ma se hai la possibilita' di farlo subito, perche' no.
La mia mente si e' esaurita per il momento 
Fammi sapere |
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