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erdogan
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
 Inserito il - 23 settembre 2010 : 03:46:41
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salve a tutti utenti del forum!!ho bisogno di aiuto se permettete!!ma dunque questo schema è un esempio di pcr??cioè vediamo se ho capito:::al momento della sintesi per amplificare la sequenza di dna interessata occorre la presenza dei primes,ossia filamenti di innesco+enzima dna polimerasi. si crea una inserzione nucleotidica,data dalla presenza dei primers??gentilmente ringrazio
Per fare un inserzione:
hai una situazione tipo
5'-----------X---------------3'
e vuoi inserire un tratto di DNA dove c'e' la X
Usi 2 coppie di primers fatte cosi:
--->
5'------------X------------3'
<--X
AAABBB
BBBCCC
X-->
5'------------X------------3'
<---
(nota, nel mio disegno lettere uguali sono complementari, cioe' BBB sara' complementare a BBB, ovviamente nella realta' avrai tipo CGTTGC e GCAACG)
Amplificando otterrai (fai 2 PCR separate con i 2 primers):
5'------------X
------------XAAABBB
e, dall'altra coppia
BBBCCCX-------------
X------------3'
Ora mischi il tutto e avrai qualcosa tipo
-----------X BBBCCCX-----------
-----------XAAABBB X-----------
Fai un primo passaggio denaturando e aggiungendo Taq
BBBCCCX--------
--------XAAABBB
I due filamenti saranno completati e ti daranno
--------XAAABBBCCCX--------
--------XAAABBBCCCX--------
Puoi poi amplificare il tutto con dei primer x il 5' e il 3'.
---
Per la delezione la cosa e' molto simile:
Parti da
--------XXXXXXXXX----------
--------XXXXXXXXX----------
(X e' la parte che vuoi eliminare)
Usi primer con code complementari
->
--------XXXXXXXXX----------
--------XXXXXXXXX----------
<--
AAA
e
AAA
-->
--------XXXXXXXXX----------
--------XXXXXXXXX----------
<-
Otterrai
-------AAA
-------AAA
e
AAA-------
AAA-------
Procedi poi come sopra!
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tittideby
Nuovo Arrivato
65 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2010 : 22:50:14
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ciao premetto che il tuo schema mi confonde un po' sarà l'ora,scusa ma non ho pazienza di comprenderlo....per la pcr....affinchè possa esserci un'amplificazione ti servono grosso modo 3 cose: dna polimerasi,primers( reverse e forward) e oligonucleotidi.Dico grosso modo perchè in realtà per far avvenire una reazione corretta sono necessari anche alcuni ioni un certo pH ecc...ma andiamo alla tua domanda.Non capisco che vuoi dire con si crea un'inserzione?La pcr è una reazione di amplificazione cioè ti serve per far in modo che a partire da una molecola di DNA tu possa averne con n cicli ,2 alla n molecole.I primers ti servono da innesco una sorta di mattoni per poter poi costruire il muro.A partire dai primers la polimerasi allunga il filamento chiaramente con l'aggiunta di nucleotidi.Bada bene però per far avvenire una corretta pcr sono fondamentali le temperature di ogni step....saprai che le reazioni fondamentali sono 3: denaturazione,annealing e amplificazione ognuna con una temperatura diversa.
Chiedi pure se non sono stata chiara .
Ciao |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2010 : 08:44:24
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Visto che l'hai copiato da una discussione intitolata "PCR e mutagenesi", direi di sì. Tuttavia è un'applicazione particolare della PCR, utilizzata per fare della mutagenesi.
Qui la discussione completa, per chi fosse interessato: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1168
PS: erdogan, ti avevo mandato un messaggio privato la settimana scorsa, potresti gentilmente rispondere? |
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erdogan
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2010 : 23:03:41
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| grazie per avermi avvisato.messaggio privato con risposta inviato,chick80!!chiedo scusa. ne approfitto per chiedere un altro dubbio.nell'esperimento mutagenesi sito specifica in vitro,posso utilizzare batteri plasmidi??perchè ho dei dubbi!! |
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