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Ciajka87
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 01 ottobre 2010 : 17:28:06
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Ciao a tutti,sono nuova del forum, laureanda in biologia sanitaria e stagista presso una ditta di detergenti.
Mi è stato chiesto di dosare le proteine presenti all'interno di un detergente enzimatico e mi è stato fornito il protocollo del metodo di Lowry (o Folin). Praticamente devo fare una curva con gli standard a conc. note di BSA e interpolare e interpolare i valori di assorbanza dei campioni in esame per trovare la loro concentrazioni.
Devo fare i dosaggi a intervalli regolari di tre ore per saggiare la stabilità delle proteine contenute nel detergente. Ciò che mi aspettavo era una diminuzione dell'assorbanza col passare per tempo, segno che le proteine si degradano e diminuiscono.Invece l'assorbanza aumenta in modo quasi esponenziale e l'unica spiegazione che posso darmi è che la degradazione delle proteine intorbidisca il campione e lo spettrofotometr lo rilevi come un aumento dell'assorbanza.
Avete mai avuto un problema simile? Come l'avete risolto e/o come vi spieghereste questa assorbanza così alta?
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juliette85
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 07 ottobre 2010 : 13:50:54
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| Ciau! Dunque ho letto in giro, e il metodo di lowry si basa sulla capacità dei legami peptidici di reagire con il rame, producendo Cu+ in circostanze alcaline...potresti provare a vedere se il pH del detergente cambia e influenza così il valore di assorbanza... |
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sim.0161
Nuovo Arrivato
Prov.: PI
Città: Pisa
2 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 12:31:52
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| Se il detergente è abbastanza diluito potrebbero crescere dei batteri, che intorbidiscono la soluzione... ma non credo che facciano così in fretta, specie in presenza di detergente... |
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Ciajka87
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2010 : 16:17:17
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Mhh..allora rifarò sicuramente il test misurando anche il pH, tuttavia il reagente A utilizzato per i protocolli di Lowry è basico, appunto per facilitare la produzione di Cu+. Però magari la variazione del pH influenza il modo con cui si creano dei legami, pur restando nell'intervallo di pH7-14..Grazie per l'imput, adesso testo!! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2010 : 23:13:22
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Sparo a caso, più per venire smentito da qualcuno più esperto che per reale convinzione che queste siano le ragioni del tuo problema: se per qualche ragione la reazione avviene più lentamente, potrebbe essere dovuto a questo rallentamento la concentrazione crescente a intervalli di tempo così elevati. Oppure se l'enzima lega come cofattore rame con la degradazione della proteina ciò potrebbe liberare il metallo.
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chim2
Utente Attivo
2110 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2010 : 15:43:03
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bisogna vedere il campo di linearità del metodo,perchè già gli errori strumentali non consentono quasi mai la linearità per analiti in matrici più complicate,poi si la variazione di assorbanza dipende sicuramente dal rame che se crea complessi per i suo orbitali d la soluzione assorbira a lunghezze d'onda diversa e quindi forse hai sbagliato a scegliere la lamba perchè dovresti mettere quella delle proteine che legano il rame e non quella senza rame.
Inoltre non stai trovando un'analita ma più analiti il tuo metodo mi sembra sbagliato a priori tu stai registrando l'assorbanza della soluzione e non di tutte le proteine presenti è diverso!
un metodo più corretto oltre a considerare l'additività dell'assorbanza dgli analiti rispetto a quella della soluzione,è MLRA (REGRESSIONE LINEARE A DIVERSE LUNGHEZZE D'ONDA),perchè ovviamente ogni proteina ha un suo massimo di assorbimento...
onestamente non so perchè ti hanno proposto questo metodo io direi che è sbagliato a priori cioè nell'impostazione
P.S. Lambert-Beer non è quasi mai lineare quindi ti conviene vedere come è stato chemiometricamente convalidato il metodo perchè tu ipotetico puoi registrare ogni dato che vuoi ma non è detto che ha significato fisico solo perchè te lo dà lo strumento! |
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chim2
Utente Attivo
2110 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2010 : 15:47:09
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| negli spettri di soluzioni torbide l'assorbimento aumenta in modo costante al diminuire della lamba quindi come vedi è impossibile ritenerlo lineare!per eliminare l'assorbimento dovuto alla torbidità di una soluzione devi fare gli spettri in derivata o te li fai fare da un programma o te li fai a mano..già per trovare il fenolo nelle acque si fa fino alla derivata seconda cmq a livello di misura fno alla derivata 4 ci puoi arrivare |
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