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Discussione |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
 Inserito il - 06 ottobre 2010 : 12:04:44
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più e più volte mi è capitato di leggere che stimolando con varie sostanze le celluline, e volendone valutare gli effetti (proliferazione e quant'altro), le cellule venivano coltivate under low serum!!
La mia domanda sorge spontanea: PERCHE? A QUALE SCOPO?
e anche: QUANDO SI DEVE FARE QUESTA PROVA CON IL LOW E QUANDO CON HIGH.
Spero che riuscirete a sciogliere questo dubbio!!!
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2010 : 12:17:17
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 non è che devi fare una prova con il low e una con high serum.. tenere le cellule in questa condizione definita "serum starvation" porta al blocco in G1 delle cellule, è pertanto un sistema per sincronizzarle prima di valutare l'effetto di un trattamento farmacologico sul ciclo cellulare. Altrimenti nella tua popolazione avresti in ogni momento delle cellule in S altre in G1 altre in G2 o M ed effettuare l'analisi del ciclo cellulare diventa più complicato. Come mi è stato detto però questo sistema non è il massimo, perchè immagina di tenere un tizio a pane e acqua una settimana e poi mollargli un pugno in faccia, è abbastanza facile che non lo schivi, se fosse stato nelle sue condizioni ottimali sarebbe successo lo stesso? |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2010 : 12:26:30
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| Molti preferiscono evitare l'utilizzo di sincronizzatori chimici o della serum starvation, e ottenere lo stesso risultato con la BrdU data per pochi minuti, es 20 minuti su cellule con un ciclo cellulare di 24h, in modo da essere ragionevolmente sicuri di "fotografare" la reale fase S..la BrdU viene incorporata solo da cellule in fase S, un tempo così breve permette in linea di massima di escludere la possibilità di avere cellule che erano in G1 al momento della somministrazione di BrdU (e quindi in S al momento dell'analisi ma negative per BrdU) e cellule che erano in S e ne sono uscite (quindi in G2 al momento dell'analisi ma positive per BrdU). |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2010 : 12:52:02
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sei stata chiarissima.
Per chiudere con il discorso di chiederei dei dettagli sul LOW SERUM, nel senso... quanto "low" e per quanto tempo va applicata questa condizione. Se per esempio io ho delle cellule che crescono al 10% di siero, in che condizioni dovrei farle crescere per essere sicuri di essere a LOW SERUM, e per quanto tempo prima della somministrazione della small molecule? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2010 : 14:16:16
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Citazione:
Molti preferiscono evitare l'utilizzo di sincronizzatori chimici o della serum starvation, e ottenere lo stesso risultato con la BrdU data per pochi minuti, es 20 minuti su cellule con un ciclo cellulare di 24h, in modo da essere ragionevolmente sicuri di "fotografare" la reale fase S..la BrdU viene incorporata solo da cellule in fase S, un tempo così breve permette in linea di massima di escludere la possibilità di avere cellule che erano in G1 al momento della somministrazione di BrdU (e quindi in S al momento dell'analisi ma negative per BrdU) e cellule che erano in S e ne sono uscite (quindi in G2 al momento dell'analisi ma positive per BrdU).
Ma questa scelta non diventa inutile se associ all'incorporazione di Edu
un marcatore di ciclo cellulare come il PI o la 7-AAD ? (in condizioni di
permeabilizzazione, ovviamente..). Domanda da semi-ignorante.
Citazione:
in questa condizione definita "serum starvation" porta al blocco in G1 delle cellule,
Non lo sapevo: vale anche per cellule primarie coltivate in GF ricombinanti e senza siero?
(ovvero, se tolgo i GF, non essendoci siero, mi devo attendere un blocco massivo in fase G1?)
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2010 : 19:50:49
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Ovviamente la valutazione della fase S con la BrdU si fa in biparametrica con la valutazione del contenuto di DNA. Chi è contro l'uso di metodi come l'APC o la serum starvation per la sincronizzazione delle cellule lo è perchè sono tutti sistemi che perturbano il ciclo cellulare e non è così ovvio quindi che l'effetto riscontrato dopo la somministrazione del farmaco non possa essere anche attribuito (parzialmente) a queste manipolazioni.
Per quel che riguarda le concentrazioni da usare non saprei dire, nè per quel che riguarda terreni con GF senza siero, perchè non ho mai fatto esperimenti di sincronizzazione..ho letto esempi in cui per cellule coltivate normalmente al 10% di siero si passava allo 0.1% per 2-3 giorni ma non so se dipenda dalla linea cellulare che si utilizza..probabilmente sì |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2010 : 00:10:06
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| Conta anche che in generale qualsiasi trattamento si voglia fare per valutare qualsiasi cosa lo si deve sempre fare dopo aver lasciato le cellule almeno 12-24h SENZA siero. Il siero è un medium complesso a composizione indefinita, quindi potrebbe contenere sostanze che interferiscono con il tuo esperimento! |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2010 : 08:08:27
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toh non lo sapevo...ps ho guadagnato una stellina |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2010 : 09:45:41
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| chick... SENZA siero non è lo stesso che dire "UNDER LOW SERUM"... Quindi tu mi consigli di togliere completamente il siero?! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2010 : 19:58:11
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Sono due cose diverse. Quello che dice la_fra serve per sincronizzare le cellule (utile se studi la proliferazione), ma devi lasciare le cellule in coltura 3-4 giorni, quindi almeno un po' di siero devi darglielo, poverine! :)
Io quando toglievo il siero lo facevo overnight o poco più, soprattutto perchè facevo trattamenti ormonali e il siero può interferire con questo tipo di trattamenti. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2010 : 23:07:09
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In realtà quello che non ho capito, la_fra, è perchè
mai fare un pulse così breve quando puoi far sì che
le tue cellule si ripartiscano lungo tutte e tre
le fasi (G1, S, G2) in modo tale che tu possa
valutarne il ciclo cellulare in modo più completo.
(io faccio così con le mie celluline: le lascio
incorporare EdU per almeno 4-5 ore) |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 09:48:01
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| ok... ma io sono un po' costretto ad utilizzare la Low Serum condition. Se ho ben capito quello che vuoi dire (chick80) è che se faccio indagini di proliferazione vado con low serum condition anche per tutta la durata dell'esperimento. Se invece volessi chennesò vede effetti molecolari dovuto all'azione della mia small molecule allora devo agire overnight COMPLETLY senza siero e poi stimolare le mie cellule sempre nel terreno privo di siero? |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 21:22:27
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@ Dionysos innanzitutto perchè sia la BrdU che l'EdU (anzi l'EdU in misura maggiore) non sono il massimo per le cells, a certe concentrazioni o tempistiche hanno una funzione antimetabolita e alterano la distribuzione delle cells nel ciclo cellulare. Poi perchè comunque una biparametrica BrdU/DNA permette di vedere benissimo le altre fasi e tanto più corto è il tempo di incorporazione tanto più ho il segnale reale della misura cioè le vere cellule in S, per quanto ho scritto sopra. Le cellule le vai ad osservare a diverse tempistiche dopo il labeling per seguire la cinetica del ciclo cellulare.
Sostanzialmente comunque non è sbagliato (posto tu abbia una concentrazione e tempistica non tossica o citostatica) esporre le cells per un tempo maggiore, dipende da cosa vai a vedere. Per esempio marcando per più tempo puoi vedere la porzione di cellule quiescenti, che nel corso del ciclo non incorporano mai.
Un pulse breve permette di discriminare la percentuale realmente in S e le perturbazioni indotte da un farmaco, considerando sempre però che l'esposizione alla Br/EdU dipende strettamente dal tempo di duplicazione delle cellule.
Comunque se si fanno trattamenti farmacologici un pulse con la BrdU/wash/aggiunta farmaco è meglio della sincronizzazione perchè le cellule sono meno sofferenti, se ti interessano questi dettagli ho un po' di materiale che non so se posso caricare sul sito. Semmai ti mando una mail |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 21:34:05
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| @ kristanko non credo tu possa lasciare le tue cells per tutto il tempo del trattamento farmacologico senza o in low serum sennò le lasci bloccate in G1 o comunque crescono con molta fatica, metti che vai ad utilizzare un intercalante o un inibitore della mitosi su cellule tumorali, come fai a valutare l'effetto se le cellule non replicano attivamente? Io ho sempre capito che si lascia in low serum per sincronizzare, poi si mette medium fresco con la normale concentrazione di siero e poi si inizia il trattamento con il farmaco, ma non ne sono sicura.. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2010 : 01:02:18
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| Tutto ciò (mi) è molto interessante!! m'interessa moltissimo entrare nei dettagli, scrivimi pure in pvt, grazie! |
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dubbio esistenziale. UNDER LOW SERUM
