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mandolino
Nuovo Arrivato

0602_da_carmilla983
Città: Trondheim


17 Messaggi
Inserito il - 07 ottobre 2010 : 16:02:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mandolino Invia a mandolino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti! sto cercando di costruire un vettore e vorrei inserire un frammento che e' stato digerito con HincII in un sito per SmaI..pensate sia fattibile?

Grazie in anticipo per l'aiuto!

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi
Inserito il - 07 ottobre 2010 : 16:58:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
beh sono entrambi blunt end, quindi sì. Tieni solo conto che con clonaggi hai i seguenti svantaggi: non hai direzionalità, il vettore ti si richiude + facilmente (se la defosforilazione non è totale, e in genere -almeno con la ciap- non è mai efficiente al 100%; tra l'altro le fosfatasi alcaline defosforilano peggio proprio le estremità blunt e le 3' recessive). La reazione di ligation inoltre è un pochino meno efficiente che con le estremità coesive.
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mandolino
Nuovo Arrivato

0602_da_carmilla983

Città: Trondheim


17 Messaggi
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 09:47:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mandolino Invia a mandolino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille per la risposta e la chiarezza nella spiegazione. Hai un buon protocollo per fare la reazione di ligation?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 17:08:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
dunque io uso la t4 ligasi della NE biolabs. Funziona benissimo. Ma il principio si applica a tutte le ligasi (se hai invitrogen o altro va bene uguale).

Uso:
2 ul di buffer 10X
1 ul di T4 ligase
x ul di vettore e inserto nell'appropriato rapporto (generalmente uso ratio 3:1 inserto:vettore, puoi anche provare altri ratio - e usa come quantità TOTALE di DNA tra i 50 e i 100 ng)

porta a 20 ul totali con H2O mQ.


Lascia a R.T. per almeno 2-3 orette (io generalmente trasformo dopo questa incubazione con metà della reazione - 10 ul) l'altra metà la metto a 16 °C Over Night, non si sa mai può sempre tornare utile. Poi comunque se non serve la congelo.


Buona fortuna
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