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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 24 ottobre 2010 : 11:43:13
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Buona Domenica a tutti,
Vi chiedo delucidazioni in merito ad un mio esperimento di dottorato.Premetto che mi occupo di coltura in vitro vegetale e la preparazione del substrato è il mio pane quotidiano. Un classico substrato consiste in sali inorganici macro e micro(spesso presenti in miscugli già pronti), vitamine, amminoacidi e altre sostanze organiche,agar, la fonte di zucchero (in genere è il saccarosio), il ph è aggiustato a 5,6-5,7 e poi c'è la sterilizzazione in autoclave a 121° per 10-15 min.Ovviamente i substrati vengono modificati nei loro componenti sia nelle quantità che nel tipo a seconda dei protocolli.Ultimamente ho aggiunto il D fruttosio così come è genericamente indicato in un articolo ma mi è venuta una serie di dubbi sull'effettiva presenza del fruttosio a fine sterilizzazione...cioè in pratica non so se effettivamente è una vera modificazione del substrato.Infatti il colore del mezzo è più scuro (secondo me il fruttosio caramellizza) e ho letto che a differenza del saccarosio il punto di fusione è intorno ai 100°.
Quindi vi chiedo delucidazioni in merito.
A questo punto non so come aggiungerlo salvaguardando il ph e la sterilità del mezzo.Sto continuando a cercare sui testi ma nessuna spiegazione in merito.
Grazie
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Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2010 : 15:06:02
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| Se hai questo problema potresti provare a fare così, autoclava solo acqua e agar e aggiungi tutti gli altri componenti dopo. Ad esempio io per fare terreni per i lieviti il glucosio lo autoclavo a parte e poi lo aggiungo insieme ad altri componenti (autoclavati anche questi da soli) all'acqua e agar. |
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 10:42:16
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Senti io metto normalmente fruttosio nei mezzi e dopo autoclave lo quantifico tramite HPLC. C'è una leggera fluttuazione in negativo, ma sempre inferiore al 10%(non è che sia poco, lo so, però per quanto mi riguarda può andare).
Altrimenti puoi provare a sterilizzare una soluzione di fruttosio a parte per filtrazione. Però devi cambiare la membrana filtrante ogni pochino perchè si intasa. |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 11:36:24
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Grazie per le vostre risposte ma devo considerare che devo mantenere un certo Ph...e il fruttosio lo modifica.Pensavo di aggiungerlo al mezzo precedentemente sterilizzato sciogliendolo in un piccolo volume e sterilizzandolo per filtrazione ma il controllo del PH non lo posso fare sotto cappa e quindi la sterilità del mezzo si perde |
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mak_steon
Utente Junior
138 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 12:05:33
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Non so se ne vale la pena, dipende da quanto vuoi essere preciso, comunque potresti fare delle prove a vari pH. Mi spiego meglio: prepari il mezzo senza fruttosio a vari pH e vedi quale è il valore giusto in modo che dopo l'aggiunta del fruttosio sterilizzato per filtrazione il pH sia quello che vuoi te.
Altrimenti potresti vedere che quantità di acido ti serve per pHre il tuo mezzo con il fruttosio e mettere quella quantità a prescindere se metti il fruttosio prima o dopo.
Entrambi i metodi non garantiscono però nè precisione nè ripetibilità; quindi non so se ne vale la pena.
Se però ti viene qualche idea fammi sapere, che interessa molto anche a me. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 12:56:38
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In generale il fruttosio, come il glucosio, non si autoclavano perchè appunto caramellizano.
Il controllo del pH (p minuscola e H maiuscola, vi prego!) lo puoi fare sottocappa usando delle cartine al tornasole. OK, non sono precise come un pH-metro, ma meglio di niente o magari aggiungendo del rosso di fenolo nel medium (se non interferisce con i tuoi esperimenti).
Oppure, se hai un micro-pHmetro puoi prendere una piccola aliquota del terreno e misurare il pH di quella fuori dalla cappa. |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 18:06:40
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forse sarebbe meglio capire quanto varia il pH del mezzo con l'aggiunta di un volume definito e piccolo di soluzione al fruttosio!
In questo modo autoclavando un mezzo a ph noto iniziale senza fruttosio posso poi aggiungere sotto cappa quel volume di sol. al fruttosio filtrato tale da portare il pH al valore voluto.
Sarà uno spasso
PS: ovviamente il volume deve essere sufficiente a sciogliere il mio quantitativo di fruttosio (mi regolo con la solubilità in g/L) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 18:35:35
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Basta che fai una prova fuori cappa.
Fai il medium senza fruttosio, misuri il pH, poi aggiungi il fruttosio e rimisuri il pH.
Se hai un tampone nel medium (come dovresti) il pH non varierà. |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 18:50:58
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| Non credo ci sia tampone nel mezzo per quanto sia un preparato industriale...infatti il pH lo dobbiamo sempre aggiustare con KOH o HCL....ma sicuramente devo fare delle prove fuori cappa |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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chim2
Utente Attivo
2110 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 18:58:21
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Citazione:
Messaggio inserito da ser
Non credo ci sia tampone nel mezzo per quanto sia un preparato industriale...infatti il pH lo dobbiamo sempre aggiustare con KOH o HCL....ma sicuramente devo fare delle prove fuori cappa
aspetta ma non penso sia rilevante il fruttosio con il discorso del pH perchè al max ti passa da un anomero all'altro ma sempre in ciclo lo trovi prevalentemente,quindi non dovrebbe influenzarti di molto il pH anche perchè non essendo un disaccaride non è che hai problemi di idrolisi  |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 19:05:28
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Cioè, non c'è bicarbonato o HEPES o qualcosa del genere?
questi sono i componenti del substrato...non mi sembra!
http://it.wikipedia.org/wiki/Terreno_di_Murashige_e_Skoog
Per chim2
ho notato che quando aggiungo il fruttosio il pH scende rispetto al mezzo senza... ma domani riverifico meglio |
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chim2
Utente Attivo
2110 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 19:09:28
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| riferito all'acqua o altri mezzi?di quando scende scusa se posso?(cosi' ci rifletto meglio),tieni presente che dipende anche da quanda massa di fruttosio hai |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2010 : 19:19:26
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| domani ti dirò meglio...farò una prova ma considera che quando preparo il mezzo normale(sali e saccarosio)in acqua bidist. il pH iniziale è 5,1- 5,2 circa che devo portare a 5,7 poco più o poco meno prima di autoclavare.Considera che in questo mezzo il saccarosio è 30 g/L.Quando aggiungo il fruttosio ( 10 g/L) il pH iniziale mi scende a 5,0 o poco meno...potrebbe sembrare un nonnulla ma lo devo considerare perchè nel protocollo devo dare un pH preciso. |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2010 : 13:23:45
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Allora ragazzi,
in laboratorio ho fatto una prova...con soli 100 ml di mezzo alle stesse conc. il pH iniziale era 5,18 quasi a volume nel senso che mancavano meno di 5 ml a 100.Il fruttosio l'ho disciolto nei 5 ml e così aggiunti...il pH è sceso a 5,13 che a dire la verità ci potrebbe stare nel senso che a questo punto mi conviene agire in questo modo:
1)preparo il mezzo senza fruttosio a volume appena inferiore e con un pH di poco superiore ( 5,75 anzicchè 5,7).
2)sterilizzo e faccio raffreddare un pò (temp. di 70-80 °)
3)sotto cappa filtro e aggiungo al mezzo un piccolo vol di soluz. con la quantità di fruttosio desiderata.
Credo che sia il migliore modo.
Che ne pensate? |
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chim2
Utente Attivo
2110 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2010 : 13:28:52
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è come sostenevo io il pH non varia molto appunto  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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stabilità fruttosio
Didattica
