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Heather
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: Montorio al Vomano
12 Messaggi |
 Inserito il - 26 ottobre 2010 : 16:10:06
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Salve a tutti!ho visto che in questo forum ci sono persone che rispondono velocemente e in maniera molto pertinente  ...per cui vi chiedo gentilmente se potete suggerirmi un protocollo per tagliare al criostato un cervello di topo, dalla fissazione dell'organo al taglio!le sezioni poi serviranno per esperimenti di immunofluorescenza....grazie mille!!!
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Dex
Nuovo Arrivato
Città: Milano
12 Messaggi |
Inserito il - 30 ottobre 2010 : 23:03:24
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Ciao Heather!
Dal fissaggio al taglio? Il taglio e' semplicissimo, ma il fissaggio dev'essere fatto bene. Per il fissaggio dell'organo la cosa migliore sarebbe perfondere l'animale con paraformaldeide (PFA) al 4%. Poi espianti, lavi con PBS, e post-fissi in PFA 4% per un periodo che va da 1 a 24 ore. Meno lasci e più si preservano gli antigeni (soprattutto quelli di membrana), più lasci e più l'architettura del tessuto rimane intatta.
Poi fai un paio di lavaggi con PBS, e trasferisci il tessuto in una soluzione di saccarosio al 30%, a 4°C, per almeno 24 ore. Fatto questo puoi togliere il saccarosio in eccesso con carta assorbente e immergere il tessuto in OCT. Quindi congeli il più rapidamente possibile (azoto liquido o ghiaccio secco).
Il cubetto lo puoi conservare a -80°C per un tempo indefinito oppure lo puoi tagliare subito. Lo spessore delle sezioni lo decidi tu in base a quello che devi fare dopo. Se hai un confocale puoi fare anche 30 micron, se no non più di 20 micron. Per tagliare fette sottilissime (10 micron) devi avere uno strumento all'ultimo grido e una lama super, se no non ce la fai...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2010 : 01:55:50
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Citazione:
Per tagliare fette sottilissime (10 micron) devi avere uno strumento all'ultimo grido e una lama super, se no non ce la fai...
Concordo per la lama super, ma lo strumento all'ultimo grido non è necessario. Noi usiamo un criostato degli anni '70 e funziona ancora benissimo. |
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Heather
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: Montorio al Vomano
12 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2010 : 16:23:05
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| Grazie mille Dex!!! vi chiedo solo un'ultima cosa....un'alternativa a questo protocollo potrebbe essere congelare l'organo (il cervello) direttamente a -20 nel criostato in OCT, dopo l'immersione in saccarosio???grazie ancora... |
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Dex
Nuovo Arrivato
Città: Milano
12 Messaggi |
Inserito il - 03 novembre 2010 : 18:36:15
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Citazione:
un'alternativa a questo protocollo potrebbe essere congelare l'organo (il cervello) direttamente a -20 nel criostato in OCT, dopo l'immersione in saccarosio???
Heather, non ho esperienza in proposito, ma credo che si possa fare comunque. Il rischio è che tu abbia un congelamento poco uniforme e piuttosto lento. Il tessuto dev'essere congelato bene anche all'interno. Te ne accorgi quando tagli. Hai provato e hai avuto qualche problema, o vorresti provare? |
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Heather
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: Montorio al Vomano
12 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2010 : 10:40:06
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| Vorrei provare...in passato ho congelato in acetone/CO2 e ho ottenuto sezioni piene di buchi, quindi sto cercando di capire quale sia la metodica migliore! |
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Dex
Nuovo Arrivato
Città: Milano
12 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2010 : 11:36:42
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Acetone/CO2??? Per un fissaggio frizzante...  Forse è per quello che hai le bollicine. Non l'ho mai sentito. Puoi fissare in acetone (senza CO2) o in metanolo a -20°C. Gli alcoli preservano piuttosto bene l'architettura del tessuto, ma a me non piacciono. Un'alternativa è il congelamento di tessuti freschi senza fare fissaggio (si usa spesso per biopsie), immergendo il tessuto prima in OCT e poi in isopentano gelato (raffreddato in azoto liquido). Il congelamento è istantaneo. Poi tagli.
Mettere il tessuto in saccarosio e poi farlo congelare a -20 credo non ti dia alcun vantaggio. |
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Heather
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: Montorio al Vomano
12 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2010 : 17:11:08
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| Ma secondo voi...posso riempire un contenitore di plastica con isopentano e immergere questo contenitore in azoto liquido???l'isopentano potrebbe sciogliere la plastica? in teoria nn posso usare un semplice becker di vetro perchè si romperebbe in azoto liquido....grazie! |
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Dex
Nuovo Arrivato
Città: Milano
12 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2010 : 22:55:52
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Io usavo ghiaccio secco, ma un contenitore di pyrex resiste anche in azoto liquido. L'isopentano scioglie la plastica?  Dipenderà dalla plastica,... ma credo di no. |
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