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Donde
Utente Junior
272 Messaggi |
 Inserito il - 27 ottobre 2010 : 16:19:26
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ciao, non so se ho capito bene come si dosano le proteine sfruttando l'assurbimento in UV.
ho capito che gli unici aminoacidi che assorbono in modo apprezzabile in UV sono quelli aromatici. sapendo quindi il rapporto fra aminoacidi totali e aromatici di una proteina è possibile calcolare un coefficiente di assorbimento E tale che:
assorbimento = E x C x d
dove C è la concentrazione della proteina e d il cammino ottico. quindi sapendo E, d, e l'assorbimento si può calcolare C.
il ragionamento è giusto?
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"DNA just is. And we dance to its music." |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 27 ottobre 2010 : 22:15:53
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Non è del tutto corretto.
Nel senso che W,Y e P hanno un picco di assorbimento nell'UV attorno a 280 nm (solo per il W è esattamente a 280 nm, per la Y è suppergiù 278 nm e per P è 260 nm), ma non è l'unico range nell'UV in cui le proteine assorbono. Un altro valore spesso utilizzato in spettrometria è 220 nm, lunghezza d'onda a cui assorbe il legame peptidico e che per esempio è sfruttata dal metodo di Waddel, che considera l'assorbanza a 215 e 225 nm per poi correggere il valore dato dalla loro sottrazione con un coefficiente empirico.
In teoria potresti calcolare il coefficiente di estinzione molare di una proteina a 280 nm conoscendo il coefficiente di estinzione molare degli aa W,Y e P a 280 nm e quanto essi sono rappresentati nella molecola di interesse, che ovviamente deve dunque essere a sequenza nota, e da qui con la legge di Lambert-Beer determinare la concentrazione di una soluzione PURA del (poli)peptide in questione. In realtà è un metodo poco preciso, che presume appunto la conoscenza della struttura primaria della proteina e la sua purificazione, che non prende in considerazione la presenza di altri interferenti in soluzione (come il DNA, che ha un picco di assorbimento lì vicino, a 260 nm)e che soprattutto assume erroneamente, misurando il coefficiente di estinzione degli aa liberi in soluzione, che esso non sia assolutamente modificato dall'intorno chimico del residuo aminoacidico inserito in una catena peptidica. |
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Donde
Utente Junior
272 Messaggi |
Inserito il - 27 ottobre 2010 : 23:58:45
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| ok, ti ringrazio ;) quindi E sarebbe il coefficiente di estinzione? è giusto inserirlo nella formula in quel modo? |
"DNA just is. And we dance to its music." |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 28 ottobre 2010 : 13:33:46
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Si si, la formula è giusta, restano dei dubbi sull'applicabilità del metodo. E tieni presente che non è esatto dire che solo Y,W e F assorbono nell'UV.
Nota: mi sono accorto solo adesso di aver stupidamente confuso nella sigla ad una lettera la fenilalanina (F) con la prolina (P). Ovviamente mi riferivo alla Fenilalanina quando scrivevo erroneamente P, invece di F. Scusate la distrazione post-spritz  |
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Donde
Utente Junior
272 Messaggi |
Inserito il - 28 ottobre 2010 : 16:36:42
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| ok grazie mille :) |
"DNA just is. And we dance to its music." |
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lyily
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2010 : 16:42:06
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scusate, approfitto di questa discussione per porvi una domanda..
nel metodo di dosaggio proteico di Bratford, quali problemi può dare l'uso di una stessa retta di taratura? |
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dosaggio proteine con assorbimento in UV
Didattica
