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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
 Inserito il - 06 novembre 2010 : 12:55:35
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sto analizzando un gene che chiamo X, e so che se si effettua un knockout di questo gene (geneX -/-), si ottiene un certo fenotipo.
però non so nulla(non c è letteratura a riguardo) sulla condizione in eterozigosi di questo gene(geneX+/-), molto probabilmente perchè in tale situazione, la quantità diminuita del 50% di proteina espressa lavora bene ugualmente e non ci sono problemi.
quindi ecco la mia paura, io sto per eseguire un RNAi di questo gene, in definitiva quindi un knockdown, e ho il timore che così facendo non ottenga risultati solo perchè un minimo di trascritto espresso rimanga(in sostanza una situazione simile a geneX +/-)
altra questione rilevante, l'RNAi che andrò a fare è su animale, esistono dei lavori di RNAi di questo gene, però eseguiti su colture cellulari.
cosa ne pensate?, qual' è in linea di massima l efficienza di silenziamento dell' RNAi, si sa qualcosa a riguardo? grazie a tutti.
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2010 : 14:20:52
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Considera che
1) la condizione di eterozigosi +/- non è sempre correlato ad un livello di espressione genica del 50%, in molti casi l'espressione è pressoché identica per mancanza di feedback negativo.
2) Anche l'espressione al 50% dell'eterozigosi che indurrebbe un fenotipo al 50% spesso non è molto interessante. Tutti quelli che conosco non li pubblicano mai a meno che non venga esplicitamente richiesto dai referee oppure a meno che tu non voglia dimostrare una situazione tipo dose-effetto. L'eterozigote generalmente è un rompiscatole che ruba tempo, soldi e spesso è di difficile collocazione. A volte è più vicino al KO, a volte è più vicino al WT, spesso ha comportamenti compensativi difficili da comprendere, quindi lo si evita se si può.
3) un RNAi che diminuisca l'espressione del 50% non è un granché, generalmente il silenziamento è notevolmente più efficiente. Un RNAi medio abbassa l'espressione a circa il 10% rispetto al controllo. Ovviamente ci sono quelli pessimi che riducono al 30% e quelli mitologici che arrivano a 0,1-0,01%. Un abbassamento del 50% è davvero pessimo.
4) Effettivamente potrebbe capitare che il 90% delle tue proteine possono essere 'di riserva' poiché basta anche solo il 10% per svolgere le 'normali attività' allora anche un RNAi non efficientissimo potrebbe essere problematico. In questo caso ti converrebbe lavorare prima in vitro e dimostrare a che % di silenziamento arrivi e se le cellule hanno il fenotipo atteso. Poi magari ti interessi al vivo che sarà sicuramente più complicato
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