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Nynaeve
Nuovo Arrivato
Città: Torino
3 Messaggi |
 Inserito il - 13 novembre 2010 : 12:22:37
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Ciao a tutti,
è la prima volta che mi trovo davanti al protocollo di wb, dopo un anno di solo RT-PCR e curve di crescita..Stavo guardando il protocollo e nella preparazione dei campioni devo mettere la stessa quantità di Loading Buffer in ogni campione. Dunque io ho fatto la quantificazione delle proteine e ho ottenuto per i miei tre campioni 0,75 0,55 e 1,50 come concentrazione proteica ug/ul.
A questo punto per la PCR io portavo tutti i miei campioni alla concentrazione minore aliquotando con acqua..in questo caso con le proteine utilizzo il tampone di estrazione,il laemmli buffer, per caricare in tutti i pozzetti la stessa quantità di proteine sia in ug che in ul?
chiedo scusa per la mia stupidità ^^ ma non so che fare..
grazie a tutti!!!!
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2010 : 17:53:13
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ciao,
io faccio così.
se devi caricare i campioni in gel piccoli, allora per pozzetto potrai mettere un volume di 20-25ul, se il gel è grande, nn + di 50ul.
prenderò cm esempio il gel piccolo.
La quantità ottimale di proteine per vedere belle bande è 25ug di proteine, cioè 1ug\ul in un volume tot di 25ul.
quindi, poichè il TB (è il loading buffer) lo si usa 1x o 2x in un volume pari alla metà del tuo volume tot (cioè 12.5ul), puoi tranquillam fare i conti.
visto ke però hai dei campioni veram poco concentrati, allora equilibrandoti con quello - concentrato, potrai caricare al max 7ug di proteina a pozzetto (perkè se metti 12,5ul di TB, ti restano solo 12,5ul liberi, quindi 12,5 x 0,55 = 6,8ug).
qundi io farei così:(tengo l ordine dei campioni cm l hai scritto tu)
1.8ul campione + 4,5ul H2O + 12,5ul TB
1.12,5ul campione + 12,5ul TB
1.4,6ul campione + 7,9ul H2O + 12,5ul TB
in questo modo i tuoi campioni sono equilibrati, anke se la quantità di proteina è poca...
mettere metà del volume finale di TB è importante poichè contiene il beta-mercaptetanolo, ke durante la bollitura dei campioni permette la loro linearizzazione.
io personalmente utilizzo il TB2x di partenza, che così nel Vfinale è diluito 1:1 e diventa 1x.
se ti serve qualche altra info chiedi pure.
ciao ciao
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2010 : 17:55:36
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scusa...
ho scritto male
ho messo sempre un 1. invece che la lista
riscrivo:
1. 8ul campione + 4,5ul H2O + 12,5ul TB
2. 12,5ul campione + 12,5ul TB
3. 4,6ul campione + 7,9ul H2O + 12,5ul TB
ora si...
scusami :P
ciao
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Nynaeve
Nuovo Arrivato
Città: Torino
3 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2010 : 19:01:16
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Grazie mille!! io ero molto in dubbio se aliquotare con il buffer di estrazione oppure l'acqua..aliquotando con acqua non accade nulla durante la corsa? =)
io metterò 40 ul in ogni pozzetto e 8 ul fissi con la soluzione con il beta mercapto :) il resto quindi proteine e acqua ^^ e posso metterne circa 17 ug ^^ eheh
baci |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2010 : 23:36:29
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sisi l acqua non interferisce!
in ogni caso per un gel grande 17ug non sono moltissimi...
ti consiglio di fare lavaggi poco stringenti per cercare di aumentare la rilevazione delle bande.
ciao |
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quantificazione proteine e preparazione campioni per WB
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