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roselady
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
119 Messaggi |
 Inserito il - 16 novembre 2010 : 18:21:57
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Ciao a tutti :)
Sono alle prese con un'immunoprecipitazione fatta in lab per la tesi e non ho capito una cosa,spero che possiate aiutarmi!
Allora,ho un estratto proteico che viene incubato con una resina durante la fase di Precleaning...l'estratto proteico è quindi privato delle proteine che si legano alla resina e in un certo senso "pulito" .Lestratto proteico ottenuto si chiama rifiutato e viene incubato con un anticorpo in modo che si formi il complesso antigene-anticorpo,appuno per immunoprecipitare.
A questo punto incubo l'immunoprecipitato con resina in modo che l'anticorpo si leghi alla proteina A della resina. Eluisco il tutto.
Devo fare un western blotting e nel gel carico i campioni :
-estratto proteico di partenza
-Eluizione del precleaning
-rifiutato del precleaning
-immunoprecipitato campione
-rifiutato dell'immunoprecipitato
-immunoprecipitato di controllo ( con anticorpo e resina soltanto)
-marker .
Ora mi chiedo :
in particolare cosa sono i campioni "ELUIZIONE DEL PRECLEANING" E "RIFIUTATO DELL'IMMUNOPRECIPITATO" ????
Scusate ma non riesco a capire T.T
per me nell'eluizione del precleaning ci sono le proteine legate alla resina di cui è stato privato l'estratto proteico e nel rifiutato dell'immunoprecipitato ci sono le proteine che non si sono legate all'anticorpo .... ho detto bene ???
Scusate se sn stata prolissa ,vi ringrazio per la risposta ! :)
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
 Inserito il - 18 novembre 2010 : 15:36:27
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allora,
il precleaning si fa mettendo il lisato totale a contatto con la resina non per togliere delle proteine, me x togliere eventuali Ig presenti nel lisato che potrebbero interferire con la formazione dell' IP.
dopo il precleaning, il lisato ke ottieni (che ha ancora tutte le tue proteine) viene incubato con l' Ig verso la proteina ke vuoi immunoprecipitare, e poi con la resina, che legherà il complesso Ig-proteina.
dopo aver fatto formare il tuo IP (resina-Ig-proteina), con delle centrifugate laverai è pellettizzerai, in modo da ottenere la sola proteina di interesse.
a questo punto puoi procedere con il WB.
ciao |
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roselady
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
119 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2010 : 16:15:57
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| ti ringrazio per il chiarimento ma lo stesso non ho avuto risposta a quello che vorrei sapere XD |
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2010 : 18:10:01
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non ho mai utilizzato questa terminologia, ma stando a quello che leggo l'eluizione del pre-clearing dovrebbe essere la resina che hai precipitato mediante centrifugazione dopo la fase di pre-clearing (la carichi per vedere che la proteina di tuo interessa non ha interagito aspecificamente con la resina credo), il rifiutato dell'immunoprecipitato io lo chiamo "unbound", e sarebbe quello che ti rimane dopo la centrifugazione che ti immunoprecipita la resina putativamente coniugata al tuo anticorpo e quindi alla tua proteina. Caricando il "rifiutato dell'immunoprecipitato" carichi tutto ciò che non si è legato all'anticorpo e quindi alla resina, cioè verifichi quindi se eventualmente una frazione della molecola di tuo interesse non si è immunoprecipitata ma è rimasta in soluzione.
Spero di essere stata utile... |
Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
Ciò che è stato nn tornerà. Il massimo che puoi fare è sperare che quello che sarà, sia meglio.
Nessun rimorso nè rimpianto, è inutile.
Carpe diem: panta rei |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2010 : 20:14:43
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nell eluizione del precleaning ci sono tutte le proteine del tuo lisato NN legate dalla resina, perkè ls resina ha legato le Ig eventualmente presenti! sarà nell'eluito della tua immunoprecipitazione vera e propria (cioè quella dopo il precleaning) che saranno presenti tutte le proteine tranne quella di interesse che invece sarà nel pellet legata alla resina.
se leggevi bene quanto ti avevo spiegato l'avresti colto! :)
Ciao |
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roselady
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
119 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2010 : 19:12:56
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| Ragazze vi chiedo scusa per il ritardo!Grazie mille per le risposte siete state gentilissime !!! :D |
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gillanto
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2011 : 11:24:13
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| io in lab ho visto una procedura un pò diversa. abbiamo fatto una serie di lavaggi delle biglie (perchè si fa?) e dopo è stato aggiunto il campione che il giorno prima abbiamo fatto reagire con il nostro anticorpo. è corretta questa procedura? forse la applicano per evitare il passaggio di pre clear? |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2011 : 11:39:38
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si può indifferentemente mettere in ordine:
campione + biglie (pre-clearing)e contemporaneamente in un'altra eppendorf biglie + anticorpo e poi unire il tutto
oppure
campione + biglie (preclearing), poi si prene il surnatante e si mette l' Ig e poi alla fine le biglie. |
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gillanto
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2011 : 15:00:05
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quindi il pre clear va sempre fatto per poi caricarlo nel gel?  |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2011 : 15:20:08
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no...il preclearing precede l'immunoprecipitazione vera e propria...
quando hai finito l'immunoprecipitazione, devi centrifugare, tenere il pellet e risospenderlo nel L.B..
poi devi bollire il campione, centrifugarlo ancora(per buttar giù i comlessi Ig-biglie e avere risospesa la tua proteina "libera") e sl allora puoi caricarlo nel gel. |
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Immunoprecipitazione
Didattica
