| Autore |
Discussione |
|
|
kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
 Inserito il - 25 novembre 2010 : 13:18:01
|
|
mi dite che pensate di questo saggio? Qual è la sua utilità? E' definito saggio di migrazione e nel mio lab mi hanno fatto un sacco di paranoie sul fatto che non serve a niente... non c'è una ratio per utilizzarlo etc... Un tumore che ha una capacità migratoria minore non è un tumore meno aggressivo?!? Quindi nell'ottica di uno studio di più caratteristiche (proliferazione, mortalità, capacità clonogenica, invasione) non ha comunque senso andare a vedere la migrazione?
|
|
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2010 : 19:45:05
|
piuttosto il saggio di migrazione fallo con il matrigel
http://homepage.uab.edu/wzhang/MatrigelInvasionAssay.html |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
 |
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2010 : 20:42:21
|
Non so nulla a riguardo, quindi non posso darti una risposta, ma se in lab ti hanno fatto una testa tanta... forse conviene chiedere loro perchè non serve a nulla! (e poi magari scrivere qui la risposta, per i posteri  ) |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 26 novembre 2010 : 09:20:13
|
| matrigel è saggio di invasione! E' una cosa un po' differente, ma tutta inquadrabile nell'ottica della capacità d'invasione delle cellule o in termini generici la capacità di metastatizzare. Io credo che si possa saggiare in vitro in tre step: capacità di migrazione, capacità di invasione (matrigel), capacità clonogenica (soft agar) |
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 26 novembre 2010 : 21:04:15
|
| Lo so che il matrigel è un saggio di invasione ma se invade migra... e la clonogenicità in soft agar e l'invasività in matrigel per me sono più valutabili del wound assay sostanzialmente per gli stessi motivi del tuo lab, difficilmente quantificabile anche perchè o stai tutto il giorno a guardare dove hai scratchato il layer o non ho capito come fai a valutare se il buco si richiude perchè le cells migrano o perchè si sono duplicate. Almeno, per me che lavorano con cellule tumorali altamente proliferanti è un test poco pratico, da quello che ho letto. Poi, ti dirò, direttamente non l'ho mai fatto |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
|
|
|
kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2010 : 09:52:37
|
beh.. innanzitutto fai delle foto a step di 24 ore, e la foto deve essere fatta sempre nello stesso punto. Il terreno deve essere privo di siero. In seguito ti porti le foto sul computer e calcoli l'area di ogni ferita e la normalizzi rispetto alla ferita iniziale. Se la cellula migra di più o di meno ci metterà più o meno tempo a rimarginare la ferita. Cellule tumorali che ci mettono di più, sono a mio avviso, meno tumorigeniche e meno invasive. E se così non fosse mi chiedo perchè numerosi gruppi di lavoro (letteratura canta) si dannerebbero tanto a usarlo IN AGGIUNTA al matrigel, non in sostituzione!
ps. non posso minimamente fidarmi del mio lab purtroppo.. sennò non chiederei al forum. |
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2010 : 11:00:25
|
ci provo anch'io questa settimana e poi ti dico se i risultati ci soddisfano
scusa dimenticavo la cosa della serum starvation |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
|
|
|
kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2010 : 11:42:26
|
allora ti scrivo tutto per bene.
- Piastri le cellule in multiwell da 6 ad una concentrazione di cellule tale da formare un monostrato di cellule (dal 50 al 70% della confluenza). Le piastri in terreno "full", cioè con la normale concentrazione di siero che utilizzi.
- Dopo che si sono attaccate (24h circa suppongo) e verifichi che sia un monostrato, fai gli "scretch" con una P200. Allontani il terreno effettui numerosi lavaggi in PBS, aggiungi terreno privo di siero.
- fai foto alle ferite effettuate, al tempo zero e a step di 24 ore finchè la ferita non si rimargina. E' fondamentale fare foto al tempo zero perchè sennò non puoi normalizzare i tuoi risultati! E' oltremodo fondamentale fare la foto sempre nello stesso punto ad ogni step.
- a test finito avrai le foto delle "ferite" sul tuo computer. Calcoli l'area di ogni ferita considerando i "fronti" cellulari che hai creato.
Il calcolo che si fa, se ad esempio hai effettuato foto fino al time point 48h, è: (Area t48/ Area t0)*100.
Otterrai delle %, più il valore si avvicina a cento, minore sarà la capacità migratoria. Io uso ImageJ per selezionare l'area considerando anche le varie inflessioni dei fronti della ferita. Effettuo numerose misure per la stessa area e poi faccio la media. Ovviamente non conta l'unità di misura con cui calcoli la distanza della ferita, purchè la misura sia uniforme per tutte le foto.
|
|
|
|
-maddy-
Nuovo Arrivato
Città: cagliari-torino
50 Messaggi |
Inserito il - 09 dicembre 2010 : 20:59:06
|
per quanto mi riguarda è il saggio di migrazione che mi ha dato + soddisfazioni....in alternativa c'è il transwell!!!
 |
|
|
|
kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2010 : 10:54:43
|
dopo studi matti e disperatissimi (no scherzo, ho letto un fottio di articoli e opinioni), salta agli occhi tale meccanismo.
Se, per qualsiasi motivo razionale, si voglia studiare il POTENZIALE METASTATIZZANTE in vitro, bisogna necessariamente ricorrere a più test per saggiare:
- Motilità
- Migrazione
- Capacità invasiva
- Capacità clonogenica
Su motilità e migrazione le opinioni si sovrappongono leggermente. C'è chi fa il "WOUND HEALING ASSAY" per "motilità", e "TEST DI MIGRAZIONE IN COLLAGENE" per la migrazione. Entrambi i test devono essere accompagnati da test molecolari sulle MMP (Metalloproteasi) attraverso W.B. o Zimografia!
Sulla capacità d'invasione non c'è storia: Matrigel assay!
Sulla capacità clonogenica (capacità di formare colonie da una singola cellula) il test più comune è il "soft agar". Ma non è l'unico! Cito la diluizione limite (una cellula per pozzetto) a titolo di esempio.
Molti articoli comunque richiamano la capacità di migrazione al test del "Wound healing assay" purchè sia accompagnato da analisi di altro tipo come il Matrigel per l'invasione.
Spero di essere stato chiaro,
kri. |
|
|
|
valebiotech86
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2012 : 16:13:24
|
| Ciao a tutti! dovrei fare un saggio della migrazione con cellule tumorali da glioblastoma multiforme. Obiettivo: SPESA MINIMA :) le cellule crescono in adesione con la laminina quindi non mi è possibile fare l'analisi utilizzando il metodo dello strach perchè ovviamente verrebbe tolta anche la laminina. Ho visto che ci sono dei kit che utilizzano un semplice supporto che si poggia nel pozzetto, le cellule crescono intorno poi il supporto viene rimosso e si valuta la migrazione dopo tot tempo. C’è qualcuno che ha provato a farlo con un metodo “fai da te?”. Grazie mille! |
|
|
| |
Discussione |
|
Wound Assay
