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Discussione |
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
 Inserito il - 26 settembre 2006 : 15:39:25
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Sto facendo del lavoro di clonaggio..ho trasformato delle cellule competenti con il plasmide pcDNA3.1/NT-GFP dell'Invitrogen.
Dopo la mini prep ho misurato la concentrazione allo spettrofotometro(2500ug/ml) e ho caricato 2 ul della mini prep direttamente nel gel di agarosio ottenedo 2 bande(1 molto alta all'altezza di circa 6000bp e una inferiore di circa 1000 bp). Come mai queste due bande? C'è qualche problema?
il vettore ve lo allego..
Allegato:  pcdna3_1ntgfp_map.pdf
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2006 : 16:11:01
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Di solito quando si corrono plasmidi si hanno piu' bande! Quella piu' alta corrisponde al plasimde circolare, quella piu' bassa al plasmide supercoiled, che è piu' compatto e quindi corre di piu'.
Tuttavia in questo caso mi sembra ci sia tantissima differenza tra le due bande, quindi non sono sicura che la causa sia questa! Se fai la miniprep "a mano" e non con il kit allora la banda piu' alta potrebbe anche essere contaminazione da DNA genomico!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2006 : 16:15:24
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Ciao Cristian,
Hai provato a digerire con un enzima di restrizione per linearizzare il plasmide?
Altrimenti non puoi distinguere a cosa corrispondono le bande perchè la migrazione di un plasmide circolare non è uguale a quella di un frammento lineare e inoltre (come dice Valia) hai anche la forma supercoiled. |
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2006 : 16:18:21
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| grazie proverò a digerire..ma secondo te dalla mappa del vettore che ho allegato prima, che enzimi posso usare? mi sembra che ce ne sia solo uno..con uno si linearizza ugualmente??? |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2006 : 16:24:58
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basta che ne scegli uno qualsiasi fra quelli elencati nel cloning site! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2006 : 16:45:47
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Certo ne devi usare uno! e che tagli in un solo punto altrimenti anziche linearizzare solo frammenti anche il plasmide:
1 taglio: plasmide linearizzato
2 tagli: 2 frammenti
3 tagli: 3 frammenti...
ecc...
Se hai solo il plasmide senza il tuo inserto va benissimo il consiglio di Alexo... altrimenti non è detto devi controllare che l'enzima non tagli anche nel tuo inserto! (a questo punto avresti due o più bande!)
Su internet sono disponibili vari siti in cui metti la sequenza del tuo plasmide e ti dice da quali enzimi viene tagliata e quanti tagli fa ogni enzima, ad es. io uso questo:
http://www.restrictionmapper.org/
Puoi scaricare la sequenza del tuo vettore (sul sito dell'invitrogen la trovi), inserire nel punto dove hai clonato la sequenza del frammento e poi mettere tutta la sequenza in "restriction mapper".
Se trovi un enzima che taglia 1 volta nel vettore e 1 volta nel frammento è la condizione ideale perchè:
- nel caso tu abbia solo il vettore hai una sigola banda di 6160bp
- nel caso tu abbia il vettore con il frammento inserito hai due bande (la lunghezza dipende dalla grandezza del vettore+inserto e da dove avvengono i tagli)
Spero di essere stata chiara!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2006 : 16:47:49
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| Ah dimenticavo dal sito dell'invitrogen puoi scaricare anche la mappa di restrizione del vettore! |
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 09:53:14
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| CHIARISSIMA COME SEMPRE..SEI IL MIO MITO..GRAZIE GFPina |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 11:16:24
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Grazie!!! 
Buon lavoro!  |
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esther
Nuovo Arrivato
Prov.: Caserta
Città: capua
2 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 15:44:34
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ciao a tutti devo laurearmi in biotec e devo fare la tesi sul dna mitocondriale.......qualcuno mi può aiutare a trovare qualcosa di interessante sulle regioni ipervariabili dell'mtdna e sugli aplogruppi?
vi rinhgrazio un bacio.... |
estherrrrrrrrr |
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 17:18:30
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| ho fatto la restrizione con XbaI ..dovrebbe essersi linearizzato?? uno linearizzato corre più o meno del non tagliato? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 18:00:56
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Si se la reazione di taglio è avvenuta il vettore si è linearizzato e se hai il vettore senza frammento hai una banda di 6160bp.
Se hai il vettore con il frammento non lo so perchè non so la sequenza e se XbaI taglia nella tua sequenza!
Potresti avere una banda a PM corrispondente a quello di vettore+frammento o più bande (la cui somma ti dovrebbe dare sempre quella di vettore+frammento)
Citazione:
uno linearizzato corre più o meno del non tagliato?
Il vettore linearizzato corre "normalmente" cioè vedi la banda al suo peso effettivo, quello circolare non ti dà una banda netta ma varie bande a secoda dei gradi di superavvolgimento.
Ciao  |
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 18:01:04
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| PER gfpina... MA SUL LINK KE MI HAI DATO, SE INSERISCO LA SEQUENZA DEL PLASMIDE DEVE SCEGLIERE "CONFORMATION CIRCULAR"?.. QUINDI UN'UNICO ENZIMA IN UNA CONFORMAZIONE CIRCOLARE MI DA SEMPRE UNA BANDA VERO?O MI SBAGLIO??? |
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 18:05:28
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| GRAZIE..PRATICAMENTE MI HAI GIà RISPOSTO..SEI IL MIO IDOLO GFPina!!!!!!!!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
 Inserito il - 27 settembre 2006 : 18:11:00
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| Comunque confermo!!!! |
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PLASMIDE GFP
Didattica
