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provolina
Nuovo Arrivato
Prov.: Vibo Valentia
Città: vibo valentia
10 Messaggi |
 Inserito il - 29 settembre 2006 : 05:03:36
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 Ciao a tutti
è la prima volta che scrivo...
Sto cercando dappertutto la METODOLOGIA COMET(il test della cometa...)
ho trovato su internet che serve a valutare se il DNA ha subito danni attraverso la visione di una cometa
ma quello che non riesco proprio a capire è come si svolge il test..
cioè:viene fatta l'elettroforesi?perchè se poi si parla di vetrini da osservare al microscopio ...
insomma se qualcuno sapesse dirmi i vari passaggi con cui eseguire questo test vi sarei davvero infinitamente grataperchè lunedì 2 ottobre ho l'esame di biomolecolare!!!!e sono un pochino preoccupata..
grazie a tutti quanti per aver letto
un grandissimo saluto,
dona
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2006 : 08:28:59
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In pratica sospendi delle cellule in un fine layer di agarosio su un vetrino da microscopio e le lisi.
A questo punto fai un elettroforesi e aggiungi un qualsiasi colorante fluorescente che leghi il DNA.
Se la cellula aveva DNA integro i suoi cromosomi migreranno tutti insieme e vedrai una macchia fluorescente. Se il DNA era danneggiato migrerà diversamente lasciandosi dietro una coda tipo cometa.
Spesso tutto ciò viene fatto con un gel alcalino, suppongo per migliorare la risoluzione, non sono sicuro.
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provolina
Nuovo Arrivato
Prov.: Vibo Valentia
Città: vibo valentia
10 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2006 : 18:59:59
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GRAZIE INFINITE Chick80
ti sono davvero gratasei stato gentilissimo
Adesso non vorrei darti troppo fastidio(eh si sto rompendo credo..) ma avrei 1 altra domandina sempre sul test
ieri notte ho continuato a cercare e ho trovato dei progetti di ricerca in cui si parlava del test!!!!!(ma tu sei stato molto più chiaro..)
insomma si diceva che le cellule vengono LISATE IN SOLUZIONE ALCALINA perchè tale condizione provoca la COMPLETA DENATURAZIONE DI PROTEINE E L'IDROLISI DELL'RNA presenti nelle cellule mentre invece il DNA è protetto dall'idrolisi grazie alla presenza del gruppo OH sul deossiribosio,il DNA in condizioni alcaline viene solo "srotolato"
Adesso mi sto chiedendo perchè invece sul mio libro dice che L'AMBIENTE ALCALINO STABILIZZA la doppia elica
Mi sembra una contraddizione...srotolamento e stabilizzazione non sono due cose opposte?
Scusate ma forse ho fatto una domanda a cui dovrei saper rispondere...
sono molto stupida lo so...ma proprio non capisco
Vabbè,ora torno a studiare e grazie ancora per aver letto e risposto alla mia domandahehe
dona |
donatella |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2006 : 23:40:59
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Dai, non ti buttare giù così!
L'ambiente alcalino stabilizza il DNA grazie alla formazione ad es di sali sodici delle basi che ne permettono una migliore interazione.
Lo srotolamento non è la denaturazione attenzione!
Il DNA è avvolto attorno agli istoni e poi superimpaccato. Se rimuovi gli istoni il DNA si srotola, questo non vuol dire che la doppia elica si apra (=denaturazione).
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provolina
Nuovo Arrivato
Prov.: Vibo Valentia
Città: vibo valentia
10 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2006 : 16:55:32
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Grazie infite Chick80
Adesso ho capito
Sei stato davvero tanto gentile
Spero un giorno di poter saper rispondere anche io ad una delle tue domande(anche se credo sia impossibile...) per aiutarti come tu hai aiutato me
Adesso vado a studiare e poi lunedì ho l'esame
Grazie ancora
buon fine settimana
dona |
donatella |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2006 : 17:15:19
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
In pratica sospendi delle cellule in un fine layer di agarosio su un vetrino da microscopio e le lisi.
A questo punto fai un elettroforesi e aggiungi un qualsiasi colorante fluorescente che leghi il DNA.
Se la cellula aveva DNA integro i suoi cromosomi migreranno tutti insieme e vedrai una macchia fluorescente. Se il DNA era danneggiato migrerà diversamente lasciandosi dietro una coda tipo cometa.
Spesso tutto ciò viene fatto con un gel alcalino, suppongo per migliorare la risoluzione, non sono sicuro.
Scusami io invece nn riesco a vedere manualmente la cosa...dovrei preparare un gel alcalino, mettervi dentro le cellule e poi stratificare con una pipetta su un vetrino? e la lisi quando avviene? e poi come e dove applico il campo elettrico x l'elettroforesi? Rimane un mistero x me! |
Farah |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2006 : 00:10:05
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Non l'ho mai fatto, quindi non ti so dire di preciso.
Faccio un paio di SUPPOSIZIONI
1) fai un gel e lo distribuisci con una pipetta sul vetrino.
2) da un lato del gel (ancora semiliquido) pipetti un po' di cellule + agente lisante
3) ci sarà qualche marchingegno per fare l'elettroforesi su vetrino, alla fine è come un'elettroforesi normale solo che invece di avere una vaschetta grande con 2 elettrodi in cui metti il tuo gel avrai una vaschettina piccola con due elettrodi e un porta vetrino.
Metterai il lato con le cellule verso il polo - in modo che il DNA migri verso il +.
Conta che non l'ho mai fatto/visto fare quindi non ti so spiegare con sicurezza |
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Aethi
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2013 : 17:38:04
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Se qualcuno leggerà ancora questa discussione:
Nel mio laboratorio facciamo comet test per valutare il danno al DNA causato da sostanze.
In pratica si staccano le cellule e si immergono in un gel di agarosio a bassa temperatura di melting che si appone su un vetrino (già agarizzato) creando in questo modo un sandwich. Poi mettiamo i vetrini nella soluzione di lisi, che rompe le membrane e distrugge le proteine, i componenti cellulari e l'RNA, lasciando al suo posto il DNA. A questo punto mettiamo i vetrini in una vasca elettroforetica e li lasciamo nel buffer di corsa (alcalino o neutro)per far avvenire lo srotolamento, e poi facciamo partire la corsa. Al termine, neutralizziamo gli alcali e fissiamo i vetrini con l'alcol 95.
Il buffer alcalino serve per evidenziare i danni al filamento singolo: il ph alcalino denatura la doppia elica, e i due filamenti migrano separatamente. Mentre il buffer neutro serve per evidenziare i danni al doppio filamento e quindi valutare l'apoptosi provocata dalla sostanza. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2013 : 22:44:34
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Grazie mille per il contributo, per certo qualcuno approderà su questi lidi e troverà aiuto nel tuo post.
PS: benvenuto/a  |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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