RACE con GC rich region

Forum

Registrati Discussioni Recenti Preferiti Utenti Cerca Regolamento RSS Statistiche

Utilità

I libri
consigliati:

Biochimica (3 vol.)
Thomas M. Devlin

Il gene VI
Benjamin Lewin

Chimere, cloni e geni
Nicole Le Douarin

Altri Libri

Nome Utente:	Password:
Riconoscimi automaticamente

Tutti i Forum

MolecularLab

Tecniche

RACE con GC rich region

Nuova Discussione

Nuovo Sondaggio

Rispondi

Aggiungi ai Preferiti

Cerca nelle discussioni

Risorse di Tecniche di Laboratorio:

Didattica e Relazioni

InsideBlog

Siti Scientifici

Protocolli Laboratorio

Siti Scientifici

Ultime notizie

Aggiungi i tag

Quanto � utile/interessante questa discussione:

Autore

Discussione

giulella
Nuovo Arrivato

38 Messaggi

Inserito il - 05 gennaio 2011 : 09:55:49

Ciao a tutti,

vorrei chiedere il vostro parere riguardo un problema che sto avendo di recente con la 5'RACE.

Dopo aver rimosso il cap dall'RNA, vi ho legato un adapter di sequenza nota e ho continuato con due nested PCR (forward primer per l'adapter e reverse per il mio gene).

Cio' che ottengo su gel di agarosio � una banda davvero molto intensa.
Dopo clonaggio, ho sequenziato diversi cloni della stessa banda e...ottengo delle sequenze specifiche per il mio gene, ma che differiscono di diversi nucleotidi all'estremit� 5 terminale.
In tutti i casi, pero' mi ritrovo la sequenza dell'adapter.
Tuttavia, non ottengo mai l'intera sequenza della 5'UTR predetta, ma bensi' tante sequenze che iniziano in diversi punti del mio esone 1.

Quello che mi sorprende � la presenza dell'adapter che teoricamente dovrebbe legarsi al posto del cap...

Il mio dubbio �:

- � possibile che ci siano tanti inizi della trascrizione per il mio gene???

- � possibile che cio' che vedo � dovuto ad un artefatto della PCR, visto che la sequenza dell'esone 1 � ricca di GC?
In altre parole...� possibile che durante la PCR la polimerasi "salti" la GC-rich region a causa di strutture secondarie e polimerizzi direttamente il mio adapter??? O peggio, � possibile che gi� durante la retrotrascrizione l'enzima ha "saltato" qualche pezzo???

Cosa ne pensate???
Come avete risolto voi eventuali problemi di GC rich region?

Scusate se sono stata un po' prolissa...ma sto letteralmente impazzendo con tutte queste sequenze

Spero in un vostro aiuto...grazie ancora
e tanti auguri per un nuovo splendido 2011