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ellepė
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 Inserito il - 09 gennaio 2011 : 10:50:43
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Ciao a tutti!
Ho dei problemini con questi due gel elettrofoesi...mi date una mano ? dovrei commentarli, ci hanno detto che per ogni corsia si possono fare soltato delle ipotesi...
Abbiamo digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindIII sia il genoma del fago lambda sia il plasmide pBluescript II SK+. il plasmide č tagliato in corrispondenza del suo multiple cloning site (mcs). Tale mcs se no ho capito male č contenuto oppure č molto vicino al gene lacZ'. Poi abbiamo fatto la ligazione di un frammento di lambda col plasmide! dopo la ligazione abbiamo trasformato un ceppo mutante di E.Coli, DH5a, con tale plasmide ricombinante. Quando il plasmide incorporato in E.Coli non contiene il frammento di lambda( e quindi se č ricircolarizzato prima che potesse avvenire la ligazione), oppure lo contiene ma in loop ( e quindi il mcs č integro), le colonie di E.Coli risultano di colore Blu. Questo perchč il ceppo batterico E.Coli DH5a sintetizza per una beta-galattosidasi priva dell'estremitā amminoterminale, e perciō inattiva. Se la cellula viene ripristinata con il plasmide pBluescript che contiene appunto il gene lacZ' integro codificande proprio un peptide che corrisponde ai primi 16 amminoacidi della regione N-terminale mancante dell'enzima, produce la beta galattosidasi attiva. Tale enzima č capace di convertire in prodotto blu l' Xgal presente nel terreno di coltura delle piastre Petri.
Se quindi č avvenuta la ligazione fra il plasmide ed un frammento di lambda, il gene lacZ' viene inattivato e i cloni di E.Coli saranno bianchi.
Ora io devo commentare questi due gel elettroforesi ( per martediiiiiiii) e non so proprio da dove cominciare!!! vi prgo datemi una mano!!!!
GRAZIE A TUTTI IN ANTICIPOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
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Ezio
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 14:24:16
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Ciao io sono uno studente di Biotecnologie e provo a commentare i gel secondo le mie conoscenze.. come dici tu sono comunque solo ipotesi che possono essere discusse.
Intanto mi riferirō alle due immagini come Fig.A (senza doppi sensi  ) e Fig.B e alle colonne con i numeri eccetto che per la corsa del marcatore di lunghezza dei frammenti (M).
[per Fig.A quindi le colonne sono M-1-2-3-4-5-6-7-8-M e per Fig.B sono M-1-2-3-4-5-6-7-M] |
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Ezio
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 14:26:18
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Fig.A
1) la digestione del genoma di Lambda serve a identificare la lunghezza dei frammenti ottenuti dal taglio con EcoRI e HindIII confrontandoli con il marcatore noto;
2) controllo negativo: determina che quella banda contiene impuritā che non hanno a che fare con il dna in questione;
3) la banda significativa determina la lunghezza del plasmide che non contiene l'inserto di Lambda poichč proviene da una colonia blu;
4) la banda significativa determina la lunghezza del plasmide che contiene l'inserto di Lambda poichč proviene da una colonia bianca. Come ci si aspetta la lunghezza č maggiore di quella del plasmide precedente e calcolando la differenza tra le due lunghezze si puō ottenere la lunghezza dell'inserto se non era giā nota all'inizio;
5) questo risultato molto simile al controllo negativo (1) puō essere considerato un secondo controllo negativo per le colonne successive in quanto il genoma di E.coli rimane bloccato all'inizio della corsa di elettroforesi e non si visualizza quindi nel gel. E' utile invece per escludere la presenza di altri plasmidi endogeni;
6) questo risultato č molto simile al (2) in cui varia solo di poco l'intensitā delle bande. Questo puō indicare che il passaggio di purificazione (spesso laborioso da eseguire) non č conveniente in questo caso perchč non porta ad un aumento rilevante della purezza dell'estratto;
7) e 8) queste due corse corrispondono alla ripetizione dello stesso test apparentemente eppure hanno due output diversi. Ci possono essere diversi motivi che portano a questo: se la colonia di partenza č la stessa e da essa si sono eseguite due PCR in tandem il risultato (7) probabilmente č dovuto a un errore di PCR in cui il templato non si č amplificato. Se invece (come penso) le colonie bianche di partenza sono diverse il risultato (7) č da interpretare probabilmente come una colonia in cui il plasmide non č stato trasfettato e quindi non č presente nelle cellule.
8) quanto a questo risultato potrebbe essere considerato corretto, cioč una colonia costituita da cellule che contengono il plasmide con l'inserto incorporato. Tuttavia confrontando con (4) la dimensione del plasmide č diversa. Se l'inserto utilizzato per la ligazione č lo stesso non saprei spiegare questa differenza di dimensioni.  |
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Ezio
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 14:47:37
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Fig.B
1) come prima
2) qui non sono molto sicuro ma potrei pensare che le diverse bande che si ottengono con lo stesso plasmide purificato potrebbero essere riferite ai diversi stati di condensazione del plasmide che migra nel gel in maniera diversa a seconda di essi;
3) la differenza con il caso precedente č imputabile solamente al buffer in cui č presente il plasmide. Visto che le bande sono spostate tutte verso dimensioni dei frammenti inferiori, il buffer probabilmente determina condizioni denaturanti che facilitano la migrazione del plasmide (nei vari stati di condensazione) attraverso il gel
4) la digestione dello stesso plasmide dei casi precedenti con gli enzimi EcoRI e HindIII determina nel gel la presenza di una sola banda spiegabile con il fatto che nel plasmide viene eseguito un solo taglio. Come ci si aspetta dalle cellule delle colonie blu infatti, non č presente linserto nei plasmidi;
5) nelle cellule delle colonie bianche invece gli enzimi di restrizione eseguono 2 tagli producendo due frammenti: linserto di lunghezza inferiore e il plasmide lineare di dimensioni corrispondenti al risultato (4);
6) in questo caso che ripete le condizioni della corsa precedente si ottiene perō un inserto diverso. La banda del plasmide č meno intensa del caso precedente; questo farebbe pensare a condizioni di purificazione pių stringenti che hanno determinato la perdita di una quantitā significativa di DNA. La banda dellinserto č a dimensioni inferiori rispetto al risultato (5); se linserto č lo stesso del caso precedente non saprei come spiegare questa banda perché se si attribuisse la causa alle condizioni di purificazione queste dovrebbero aver interessato anche la banda del plasmide che invece rimane alle dimensioni corrette;
7) si puō ripetere lo stesso ragionamento del caso precedente se non fosse che nei risultati (5) e (6) le dimensioni degli inserti corrispondono a delle bande identificate nella colonna (1) mentre in questultimo risultato linserto non viene trovato nella colonna (1).
Per avere maggiori informazioni per interpretare le bande nelle colonne (5), (6) e (7) bisognerebbe vedere un controllo negativo come si č eseguito per la colonna 5 in Fig.A. In tal modo si potrebbe escludere o includere la presenza di altri plasmidi che legandosi al posto dellinserto di Lambda potrebbero aver inattivato ugualmente la beta-gal.
Spero di essere stato daiuto anche se non in maniera definitiva.
Ciao ciao  |
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ellepė
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 18:24:28
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grazie!!! ma ho delle domande da porti...per la colonna 5 della fig.a io avevo supposto che quella banda indicasse il genoma batteric dato che č una colonia di e.coli senza plasmide! e ho pensato quindi le seguenti 2 cose:
1. il genoma batterico č talmente ma talmente super avvolto che arriva fin laggių... e sappiamo che presi due frammenti di dna di ugual lunghezza, ma uno super avvolto e l'altro lineare, quello superavvolto migra pių gių di quello lineare...
2. il genoma batterico contiene tantissimi siti di restrizioni per i 2 enzimi utilizzati per la digestione, quindi č stato praticamente spezzettato in frammenti piccolissimi...
cioč sinceramente nn mi č neanche minimamente sfiorata l'idea che il genoma batterico non si vedesse nel gel per i motivi che hai detto tu... |
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ellepė
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 18:40:12
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poi...per quanto riguarda il punto 6 che hai scritto sullla figura a... perchč la purificazione Che č stata fatta non č il metodo pių idoneo? noi abbiamo usato alcali sds per lisare la parete cellulare, e poi la centrifugazione. qui giā mi rendo conto di aver molto probabilmente sbagliato a dire che la banda pių bassa č il genoma batterico... perchč in effetti lo scopo della centrifugazione č eliminare anche quello ( ma allora quella banda laggių....COSA čččččččččččččččččččččččč???????????? )
dopo la centrifugazione abbiamo fatto una cromatografia su una matrice di silice perchč tale matrice lega in maniera molto forte il dna plasmidico...
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Ezio
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 19:14:58
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Rispondo alla tua prima domanda sula colonna 5 in Fig.A. Il genoma batterico non viene digerito con gli enzimi di restrizione (non avrebbe senso) perché questo passaggio suppongo lo abbiate fatto con i plasmidi, poi la ligazione e poi la trasformazione dei batteri che hanno quindi il genoma intero e possono avere o meno il plasmide con/senza inserto.
Poi la banda in colonna 5 non puō essere il genoma sia per la dimensione visto che ti ho detto che rimane intero, sia per il fatto che essendo grande, anche se č superavvolto, rimane incastrato nella maglia del gel giā alla partenza dei pozzetti quindi non viene proprio visualizzato. (Questo almeno di solito eh.. se poi voi lo avete digerito o avete fatto altri passaggi fuori dal comune allora tutto č possibile
dipende anche da che primer avete usato per la PCR)
Per quanto riguarda il punto 6, non ho detto che la purificazione non č adatta ma che non č conveniente visti i risultati simili con il (3). [mi sono accorto di aver sbagliato a scrivere nel post originale.. dove ho scritto 2 in realtā č 3  ] Questa č una considerazione che puō essere fatta solo a posteriori e solo per questo caso, in alcuni casi invece la purificazione del DNA plasmidico č indispensabile per chiarire i risultati.
Inoltre visto che avete centrifugato il DNA per separare il genomico dal plasmidico, il ragionamento del commento precedente non serve in quanto il DNA genomico non lo avete proprio caricato in gel visto che č stato separato dal plasmidico.
Lultima banda in ogni colonna (se č questo che mi stai chiedendo) non č niente di significativo perché e presente anche nel controllo negativo (2) e deriva dalla mix di pcr, quindi rumore di fondo
Se hai altre domande chiedi pure, forse non scrivo tutto perché alcuni passaggi li faccio a mente. |
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ellepė
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 19:34:59
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| per il punto (7) della pcr... come puō accadere allora che il templato nn si amplifichi? scusami se ti faccio quete domande stupide ma sn al secondo anno di biologia molecolare e sinceramente molte cose nn le so, e molte altre nn le ho capite! |
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ellepė
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 19:36:34
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| per il punto (7) della pcr ho comunquer anche io pensato che il plasmide nn sia entrato nel batterio! |
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ellepė
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 19:38:22
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| per la (8) della pcr sinceramente nn so se l'insero č lo stesso, perchč a noi i dottorandi che ci han fatto laboratorio ci han detto solo di commentare questi due gel,nient'altro... perō io suppongo a questo punto che gli inserti siano diversi! |
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ellepė
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 19:43:15
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| ORAPASSIAMO ALLA FIG.B ...non ho capito cosa intendi per il punto (2) ! cioč tutte quelle bande sono lo stesso plasmide a vari livelli di superavvolgimento? e perchč? |
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Ezio
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 19:45:00
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| ritengo pių probabile la seconda ipotesi, perō a volte accade che la polimerasi viene inibita da alcune condizioni che ora non ricordo a memoria e quindi o non riesce a posizionarsi correttamente sui primer oppure effettua continuamente sintesi abortiva generando frammenti molto corti che finiscono nel rumore di fondo... |
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ellepė
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 19:46:14
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| ma i mix della pcr non sono i dNTP che servono per creare la nuova catena di dna?o ho capito male? |
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ellepė
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 19:58:05
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poi..non capisco il punto (4) della figura b...cioč...il plasmide viene digerito a livello del mcs e subisce un taglio da parte di ecorI e uno da parte di hindIII, quindi la parte che si trova in mezzo ai due siti di restrizione viene eliminata... ora,le colonie sono blu, quindi il plasmide si č ricircolarizzato perchč magari non č stato trattato con CIP, oppure si č ricircolarizzato ma comunque contiene l'inserto in loop...
ma dato che comunque si tratta sempre del solo plasmide ( trascurando l'eventualitā del loop ) prchč non si ha unaserie di bande come nella colonna 3? non sono possibili vari gradi di superavvolgimento in questo caso? e perchč? |
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Ezio
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Inserito il - 09 gennaio 2011 : 20:41:48
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Aspetta aspetta andiamo con calma perchč forse non ho capito alcune cose:
- intanto sė, i mix di pcr hanno tra le altre cose anche i dNTP.. č per essi che si crea il rumore di fondo suppongo visto che li puoi considerare come frammenti di dna lunghi 1 bp... ma non andare in dettaglio su questo o aspetta altri commenti per sicurezza..
Per il punto 4 fig B:
- sai per certo che entrambi gli enzimi effettuano un taglio? perchč potrebbe esserci il sito di restrizione di solo uno dei due nel plasmide.
- la differenza tra la colonna 4 rispetto alle 2 e 3 č che nella 4 il plasmide viene purificato e poi digerito con gli enzimi da quanto c'č scritto quindi non č circolare ma per forza lineare quindi non puō avere superavvolgimenti a differenza dei casi 2 e 3. O sbaglio? |
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ellepė
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 10:31:25
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ciao! allora...
1. per il punto 4 della fig b... noi in laboratorio abbiamo tagliato il plasmide pbsk+ con i due enzimi di restrizione ( quindi tale plasmide ha entrambi i siti di restrizione per questi enzimi nel suo mcs.. ) allo scopo di creare 2 estremitā non coesiv...cioč per essere sicuri che il plasmide nn si ricircolarizzi prima di legare l'inserto... perō comunque i dottorandi ci hanno detto che accade, e pure spesso, che il plasmide nonostante tutto si possa ricircolarizare prima.. in questi casi puō darsi che il plasmide si ricircolarizza perchč magari su di esso ha agito uno solo dei due enzimi di resrtizione? cioč č possibile una cosa del genere ? e nel caso fosse possibile, come mai, quali sono le cause di questo "fallimento" da parte di uno dei 2 enzimi?
2. sempre per il punto 4... si in effetti dovrebbe essere lineare se č stato tagliato.. =). Quindi quando un plasmide viene tagliato č necessariamente lineare? non č possibile che si superavvolga? te lo chiedo perchč su genes X per spiegare i superravvolgimenti fa l'esempio di un elastico... esempio chiarissimo! perō io ho pensato..anche se si taglia l'elastico in un puto, poi puō sempre attorcigliarsi su se stesso, anche se ha le estremitā libere!!! e magari ho pensato che fosse lo stesso per i plasmidi tagliati! bo!!! |
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Ezio
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 10:51:07
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1) Capisco adesso lutilitā dei due enzimi, in effetti lavevamo fatto anche noi credo ma non mi ricordavo. Comunque non saprei dirti perché uno dei due enzimi non funziona penso sia sempre un discorso probabilistico riguardante il tempo in cui li lasci agire
2) Questa domanda mi piace perché mi ricorda che il prof di biologia molecolare alla triennale mi ha fatto lo stesso esempio. La differenza tra circolare e lineare sta tutta nel fatto che nel lineare hai le estremitā libere quindi se avviene un superavvolgimento questo puō essere ridotto facendo ruotare una singola estremitā (anche senza lintervento di enzimi) mentre nel caso di DNA circolare il superavvolgimento puō essere ridotto solo con lintervento delle topoisomerasi che creano temporaneamente delle estremitā libere tagliando la doppia elica e poi richiudendola.
Questo accade anche per i cromosomi che pur essendo lineari sono talmente lunghi che le due estremitā (telomeri) sono considerate ancorate e il numero di superavvolgimenti che si possono creare allinterno di un cromosoma superano la possibilitā di poter ruotare i telomeri.
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ellepė
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 13:03:33
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poi posso chiederti un'altra cosa? nella relaazione devo svolgere anche 2 esercizi, dei quali uno l'ho risolto ( e vorrei sapere se č corretto!!!) l'altro non lo so fare!
1.vi viene fornita una soluzione a concentrazione 40 volte superiore alla concentrazione finale di utilizzo. Quanta soluzione e quanta acqua dovrete mescolare per ottenere 350ml di soluzione pronta all'uso? quali saranno i contenitori pių adatti per misurare i volumi che avete calcolato?
io questo es. l'ho risolto cosė :
x= conc.finale di utilizzo
40x= conc.iniziale
350/40 = 8,57 conc.finale di utilizzo
350-8.57 = acqua da aggiungere
2. vi viene fornita una soluzione di detergente 20%. se disponete di 50 microlitri di buffer, quanta soluzione di detergente dovrete aggiungere per avere una concentrazione finale di detergente pari a 1,5%
bene... a me le percentuali nn piacciono, vado in panico, quindi nn so da dove iniziare per questo esercizio... cioč mi rendo conto che č simile al primo, solo che ci sono le percentuali e mi blocco!
grazie per l'aiuto =) |
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Ezio
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 13:59:21
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Il primo č ok.
Il secondo non č poi cosė simile al primo. Sė la formula da usare č la stessa (conc.iniziale*Vol.iniziale=conc.finale*Vol.finale) perō devi tener conto del volume di buffer da aggiungere in questo caso.
Per quanto riguarda le percentuali puoi considerarle come semplici concentrazioni, il problema sorge quando devi convertirle in altro, ma non č questo caso 
Riscrivendo i dati in maniera utile possiamo dire che:
conc. iniziale = 20
vol. iniziale = x ul
conc. finale = 1,5
vol. finale = (50 + x) ul
inserendo nella formula e ricavando x dovresti ottenere 4,05 ul, cioč 4 ul...
ps: se hai altre domande diverse dall'elettroforesi fai un altro post, se interessano a qualcuno questi esercizi non li troverā mai nell'argomento "gel elettroforesi" 
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Ezio
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 14:02:13
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Citazione:
Messaggio inserito da ellepė
x= conc.finale di utilizzo
40x= conc.iniziale
350/40 = 8,57 conc.finale di utilizzo
scusa mi sono accorto adesso.. la x dovrebbe essere il volume iniziale non la concentrazione.. quella la sai.. č 40x all'inizio e 1x alla fine.. |
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ellepė
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 16:06:55
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| ciao!!! ti disturbo ancora... nella colonna8 della digestione la seconda banda nn corrisponde a nessuna di qelle d lambda...quindi il plasmide non contiene lambda.. perō la colonia č bianca ed il plasmide c'č ( prima banda ) puō essre che il plasmide abbia ligato un frammento non di lambda ma di altr dna estraneo all'esperimento? cioč...mi sembra l'unica spiegazione valida che possa unire il fatto che la colonia sia bianca col fatto che ci sia il plasmide... |
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Ezio
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 17:35:55
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| potrebbe anche essere un plasmide ricircolarizzato in una forma un po' superavvolta.. se vedi corrisponde a una delle bande delle colonne 2/3.. sono solo ipotesi ovviamente.. ma l'incorporare dna estraneo la vedo dura perchč sarebbe un errore troppo grossolano... |
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ellepė
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 22:05:06
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| ma a sto punto la colonia sarebbe blu e nn bianca...bo, almeno secondo me.. magari i miei dottorandi ci hanno starnutito dentro ed č entrato dna estraneo =) ahahah |
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Ezio
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Inserito il - 10 gennaio 2011 : 22:28:00
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| si vero.. hai ragione.. allora non so.. |
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Gel elettroforesi
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