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Daria85
Utente
678 Messaggi |
 Inserito il - 21 gennaio 2011 : 10:58:57
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ciao, si io ne ho uno!eccolo:
DISSOCIAZIONE DI EPATOCITI E COLTURA CELLULE PRIMARIE:
1STEP:la soluzione di lavaggio(HBBS w\out Ca2+ e Mg2+, glicina 2mM, alanina 2mM, Fruttosio 10mM, insulina rapida ricombinante umana 40UI\L e EDTA 2mM)viene riscaldata a 37°C e iniettata nel parenchima con una siringa con ago da insulina( x eliminare l'infiltrato ematico).si dovrebbe osservare un progressivo schiarimento del parenchima.il liquido fuoriuscito viene scartato.
2STEP:la seconda soluzione di lavaggio ha la stessa composizione della prima, ma è priva di EDTA. allo stesso modo si inietta nel parenchima cm prima(x eliminare altro infiltrato ematico e anche il chelante del Ca2+).
3STEP:il tessuto viene perfuso con una soluzione enzimatica(William's E Medium con Ca2+ e Mg2+, 0.195g Liberasi, 0.06g di DNasi, insulina rapida ricombinante umana 40 UI\L, 150mg CaCl2 in 50ml) a 37°C per 15-20min. contemporaneamente si "massaggia" il pezzo cn una pinzetta per facilitare il rilascio delle cellule della matrice cellulare.
4STEP:dopo aver ottenuto la sospensione cellulare, questa va centrifugata a 1500 rpm x 10min. si elimina il surnatante e le cellule ottenute vanno risospese in piastre o fiasche cottate con collagene 1.
il medium di coltura va sostituito il giorno seguente e poi ogni 2-3gg.
composizione medium coltura: IMDM + 20%FBS, 1% pen-strep, 1% anfoteromicina B, 1% AA nn essenziali, 1% glutammina.
ciao |
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colture primarie HCC
Didattica
