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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 31 gennaio 2011 : 15:43:21
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Salve, mi chiedevo, per i sistemi Restrizione-Modificazione di tipo II, quelli usati di prassi in lab per intenderci, la metilazione di una qualsiasi base all'interno della sequenza riconosciuta dall'endonucleasi è condizione necessaria e sufficiente perché non avvenga il taglio, oppure deve essere metilata proprio una determinata basa?
Es: se la sequenza di modificazione e restrizione è GAATTC,è sufficiente che una qualsiasi Adenina o citosina siano metilate, oppure isoschizomeri potrebbero comportarsi in maniera diversa a seconda che sia metilata una piuttosto che un'altra?
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2011 : 15:52:02
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dipende, una stessa sequenza può essere riconosciuta da un enzima se è metilata, da un altro se invece non lo è!
queste cose cmq sn indicate nel datasheet!
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2011 : 16:30:29
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Occhei, per esempio McrBC, McrA o MMrr, no? Ora però a me interessano le endonucleasi che tagliano solo in assenza di metile. Per queste cos'è valido? C'è una base precisa la cui metilazione abolisce il taglio della sequenza riconosciuta dall'endonucleasi o è sufficiente che una qualsiasi base sia modificata?
Grazie |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2011 : 19:59:24
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| beh ci sono enzimi che sono bloccati solo in particolari situazioni. Prendi ClaI per esempio, che taglia ATCGAT. Esso è Dam sensibile, nel senso che è bloccato da Dam che metila la A della sequenza GATC. Se quindi prima di ATCGAT ci trovi una G, cioè se le due sequenze overlappano, allora ClaI è bloccato. Non so esattamznte se volevi sapere questo |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2011 : 22:09:30
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Questo può essermi utile, ora però provo con un esempio, non so quanto esatto sia:
- E.R. che riconosce sequenza e la taglia se NON metilata
- Due sequenze metilate ACCA*TT e AC*CATT, dove * indica che la base precende è metilata.
C'è la possibilità che E.R. tagli una delle due oppure la metilazione blocca in entrambi i casi il clivaggio, indipendentemente dalla localizzazione del metile all'interno della sequenza?
Grazie ancora a tutti
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2011 : 22:25:34
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| a naso ti vrei risposto di, pero' ripensandoci mi sono ricordato di enzimi di restrizione sensibili a dam che metila su a e resistenti a dcm che metila su c o viceversa. Basta che guardi sul sito della neb e cerchi la lista di enzimi con le loo sensiblita', io nn so come linkartelo ora perché scfivo da cellulare. Quindi la risposta é che la metilazione puo' bloccare l'attivita' in maniera base dipedente |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2011 : 23:20:14
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| Grazie mille, avevo lasciato stare NEB in quanto era una curiosità sorta preparando un esame di genetica molecolare, ma magari darò una scartabellata casuale a datasheet vari |
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Teobromina
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2016 : 17:01:37
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| Ciao a tutti, scusate la discussione è un po' vecchiotta ma vi sarei davvero utile se foste cosi' getili da aiutarmi; avrei dei dubbi per quanto riguarda il clonaggio in coli di un dato inserto.. allora praticamente, ho l'inserto a cui devo legare i linker che mi permetteranno l'aggancio al vettore dopo averlo trattato con un oppurtuno enzima di restrizione.. per far si che l'enzima di restrizione crei delle estremità compatibili senza tagliare l'inserto, tratto prima l'inserto con una metilasi oppurtuna (quindi caratteristica per l'enzima di restrizione che devo usare). A questo punto agisco con l'enzima di restrizione, ed effettuo la ligazione.. ma se devo inserire il plasmide in coli, con i sistemi dam e dcm attivi..per impedire che l'inserto non venga degradato si dovrebbe far in modo che le metilazioni che ho fatto in precedenza siano compatibili con quelle che i sistemi dam e dcm riconoscono come self, giusto? quindi queste metilazioni come vengono fatte? devo farne due tipi diversi o devo combinarle in qualche modo?xD |
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Metilazione e restrizione
Didattica
