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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
 Inserito il - 13 febbraio 2011 : 18:04:26
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allora ragazzi, ho un problema a capire un esperimento:
TEST PER DETERMINARE LA STABILITA PLASMIDICA
ceppi di E.coli trasformati con un plasmide che ha la resistenza al Km (kanamicina) sono stati coltivati in LB-Km overnith a 37°C. La cultura è stata poi usata per inoculare LB broth con un inoculo dell'1%.
Adesso dice:
The bacteria were subcultured with an inoculum of the same size of 1%, every 12 h to achieve 7 generations of growth.
Quello che non capisco è cosa sono le subculture?? e poi come fanno ad ottenere 7 generazioni di crescita se E.coli ha un tempo di generazione di circa 20 min??
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Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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_ARY_
Nuovo Arrivato
Prov.: mi
Città: milano
81 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2011 : 19:29:31
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le subculture potrebbero esser le colonie batteriche,ma per le 7 generazioni non saprei proprio!
io ho fatto una trasformazione con i plasmidi,ma dopo che ho ottenuto le colonie ho estratto il DNA e basta!
ma cosa dovresti fare? |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2011 : 19:53:28
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Plasmid stability was determined using a method that has been described elsewhere (25). Cells were cultured in LB-Km
broth overnight at 37°C. The culture was then used to inoculate LB broth with an inoculum size of 1%. The bacteria were subcultured with an inoculum of the same size every 12 h to achieve seven generations of growth. After subculturing, cells were plated on LB agar. About 1,000 colonies were replica plated on LB-Km agar to determine the percentage of the colonies that had lost their
plasmid. Each stability experiment was performed three times.
chi mi spiega qst cosa? intendo il procedimento pratico |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2011 : 23:41:32
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quello che dici te, trasformare una cellula con il plasmide farla crescere e poi estrarre il plasmide è un controllo, lo fa perchè vuoi sapere se per esempio il plasmide che hai trasfomrato contiene un inserto (che te c'hai messo) oppure se è un semplice plasmide che si è richiuso senza includere il tuo inserto....per cui no, non è la risposta che cerco....
quello che fanno qst ricercatori è fare delle delezioni ad un plasmide nella regione adiacente al Origine di replicazione per trovare se ce n'è qualcuno che inficia sulla stabilità del plasmide stesso e di fatto dopo n generazioni la cellula batterica perde il plasmide.
quello che ho capito è che loro fanno una crescita dai batteri trasformati con qst plasmidi deleti in vadi punti in un LB contenete la Kanamicina, di modo che solo le cellule che hanno il plasmide in esame (ha resistenza alla Km) vivono. dopo le piastrano su un terreno LB senza Km contanto le colonie e infine le replica plated su un terreno LB + Km cosi che sanno la percentiuale delle cellule che hanno perso il plasmide...qst è il succo ...il problema è:
1)se leggete la parte in inglese in alto, dice che la cellule sono state coltivate in LB-Km overnight a 37 (PRE-INOCULO)
2)i batteri SONO STATI SUBCOLTIVATI???? per 12 ore al fine di ottenere 7 generazioni...
MI aiutate per cortesia |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2011 : 00:23:56
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Presupposto: se coltivi i batteri in terreno contenente l'antibiotico a cui il plasmide conferisce resistenza (nel tuo caso Kanamicina) sei sicuro che contengono il plasmide perché se lo perdessero morirebbero.
Per valutare quindi la "stabilità" del plasmide all'interno del ceppo batterico ospitante devi coltivare i batteri in assenza di antibiotico.
Quello che hanno fatto in questo lavoro è questo:
1) selezionare le cellule che contengono il plasmide e espanderle o.n.: Citazione:
Cells were cultured in LB-Km broth overnight at 37°C.
2) prenderne una parte e metterle in terreno senza antibiotico:
Citazione:
The culture was then used to inoculate LB broth with an inoculum size of 1%.
3) fare varie sottoculture sempre in terreno senza antibiotico, questo viene fatto prelevando ogni 12h una piccola aliquota della coltura e mettendola in terreno fresco, il tutto per 7 volte, da qui le "7 generazioni", non c'entra niente il tempo di duplicazione di Coli. Citazione:
The bacteria were subcultured with an inoculum of the same size every 12 h to achieve seven generations of growth.
4) dall'ultima sottocoltura si piastra su terreno solido, sempre "senza" antibiotico altrimenti morirebbero quelli che hanno perso il plasmide Citazione:
After subculturing, cells were plated on LB agar.
5) fanno un replica plate delle colonie cresciute su terreno solido, su terreno contenente l'antibiotico in modo da discriminare le colonie che hanno ancora il plasmide e quelle che l'hanno perso. Citazione:
About 1,000 colonies were replica plated on LB-Km agar to determine the percentage of the colonies that had lost their plasmid.
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2011 : 15:20:35
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ciao GFPina, intanto grazie per la risposta che mi hai dato. c'è però il punto 3 non mi è chiaro:
3) fare varie sottoculture sempre in terreno senza antibiotico, questo viene fatto prelevando ogni 12h una piccola aliquota della coltura e mettendola in terreno fresco, il tutto per 7 volte, da qui le "7 generazioni", non c'entra niente il tempo di duplicazione di Coli.
Ma le 7 generazioni, sono 7 beute diverse che derivano dalla beuta madre?? e se volessi fare 14-28...84 generazioni.dovrò prelevare l'inoculo sempre dalla beuta madre per 84 volte?? ti ho postato un grafico relativo a qst esperimento, ma sono un pò confuso, se hai un pò di tempo, potresti aiutarmi a capire bene i vari passaggi? grazie in anticipo
Allegato:  grafico.doc
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2011 : 00:09:07
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Come la capisco io è che, ogni 12h prendono un po' della coltura e lo mettono nella successiva, quindi:
dalla "coltura madre" prendono l'inoculo (1% dl totale) e lo mettono in LB-nuovo: "sottocoltura 1"
dopo 12h prendono l'inoculo dalla "sottocoltura 1" e lo mettono in LB-nuovo: "sottocoltura 2"...
ad ogni passaggio di sottocoltura piastrano su petri, fanno i conti di quante cellule hanno il plasmide e ottengono i punti da mettere in grafico.
Poi riguardo alle "7 generazioni" in effetti ti ho detto una cosa sbagliata (non è chiarissimo da quella frase), ogni 12h ci sono 7 generazioni (poi perché abbiano dei coli che ci mettono così tanto non ne ho idea!). I punti messi sul grafico verosimilmente sono i giorni, ogni giorno (quindi 24h) hai 14 generazioni, quindi i numeri: 14, 28, 42, 56, 70, 84
in tutto ci hanno messo 6 giorni!
In ogni caso credo che questa non sia una cosa così fondamentale, l'importante è capire il procedimento, poi le tempistiche e il numero di generazioni non sono così importanti.
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2011 : 01:29:03
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| ora è molto più chiaro ufff. il procedimendo di base, cioè contare la % di batteri che mantengono il plasmide l'avevo capito....il fatto è che capire tutti i punti di un esperimento è molto interessante, perchè un giorno, magari, potrò riutilizzarla...grazie di nuovo per l'auto, ciao |
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2011 : 14:38:00
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Citazione:
About 1,000 colonies were replica plated on LB-Km agar to determine the percentage of the colonies that had lost their plasmid.
ma per ottenere 1000 colone, facendo riferimento al grafico che ho postato, e guardando la 14 generazione per esempio loro hanno fatto cosi:
(sapendo che l'inoculo dell'1% contiene 5 x 10^7 cellule) hanno fatto una diluizione seriale della sottocultura della 14 generazione, per cui alla fine del primo giorno, hanno preso 1ml da qst lo hanno diluito in 9ml finali per avere un diluizione (5 x 10^6) cellule, poi hanno preso 1 ml da qst e l'hanno diluita in 9ml di acqua per avere 5 x 10^5 cellule, infine hanno piastrato 0.01ml cioè 10 ul sulla piastra con solo LB per avere circa 1000 cellule. l'hanno incubata e per esempio alla hanno ottenuto (vedi grafico) una % di cellule che mantengono il plasmide di circa 82%
allora mi chiedo:
1) per calcolare la percentuale da mettere sul grafico, quindi l'82% alla 14 geneerazione è come se nei loro dati la piastra con solo LB avesse ottenuto 820 cellule e la piastra con LB + Km avesse ottenuto 10 cellule (hanno mantenuto il plasmide) per cui
820 x 10 / 100 = 82%
secondo voi hanno fatto cosi?? |
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terreno85
Utente Junior
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Inserito il - 16 febbraio 2011 : 00:38:28
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