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15111985
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 01 marzo 2011 : 14:49:10
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ciao a tutti...ho già letto le altre discussioi riguardo al saggio di attività enzimatica...ma io ho ancora qualche problema...
in laboratorio devo calcolare l'attività di un enzima contenuto in alcuni farmaci in particolare l'attività della bromelina...è la prima volta che devo fare un dosaggio enzimatico...
se utilizzo la formula "VARIAZIONE O.D." AL MINUTO/ ASSORBIMENTO DI 1umol/ml DI ENZIMA" per calcolare l'assorbimento di una umol/ml devo inserire questa concentrazione nella provetta e calcolarlo con lo spettrofotometro??
oppure se faccio la curva di taratura con valori di attività enzimatica noti, inserendo una quantità di sostanza di cui non conosco l'attività dell'enzima posso in questo modo più semplice risalire all'attività enzimatica nel mio campione, giusto?però anche in questo caso io posso sciogliere l'enzima per ottenere una determinata concentrazione ma come faccio a sapere la quantità di enzima che devo inserire per avere specifiche U|ml quindi specifiche ttività enzimatiche??
un'ultima cosa: non mi serve a nulla vero in un dosaggio di attività enzimatico sapere la concentrazione dell'enzima contenuto nel mio campione?
scusate le tante domande e forse la difficoltà da parte vostra per comprenderle ma non avendolo mai fatto mi trovo davvero in difficoltà...grazie mile per l'aiuto
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2011 : 20:57:37
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Gosh bataman
Citazione:
Messaggio inserito da 15111985
ciao a tutti...ho già letto le altre discussioi riguardo al saggio di attività enzimatica...ma io ho ancora qualche problema...
in laboratorio devo calcolare l'attività di un enzima contenuto in alcuni farmaci in particolare l'attività della bromelina...è la prima volta che devo fare un dosaggio enzimatico...
Non capisco bene cosa vuoi calcolare. Vuoi eseguire una cinetica enzimatica, oppure dosare un analita con un saggio endpoint
Citazione:
se utilizzo la formula "VARIAZIONE O.D." AL MINUTO/ ASSORBIMENTO DI 1umol/ml DI ENZIMA" per calcolare l'assorbimento di una umol/ml devo inserire questa concentrazione nella provetta e calcolarlo con lo spettrofotometro??
sembrerebbe che vuoi eseguire una cinetica enzimatica, allora il tuo analità è un enzima e il dosaggio sarà espresso in termini di unità enzimatica (UE) dove 1 UE è definita come la quantità di enzima capace di trasformare 1micromole di substrato al minuto in condizioni ottimali (Temp, pH, forza ionica e [Substrato] saturante).
Se il tuo enzima è una deidrogenasi puoi seguire la comparsa/scomparsa del NADPH con uno spettrofotometro misurando l'assorbimento a 340 nm
Quindi scegliendo il buffer ottimale e mettendo substrato a palla, ti posizioni davanti al tuo spettrofotometro, misuri l'assorbimento della miscela di reazione (il bianco).Aggiungi un uno sputo di enzima e leggi l'assorbimento ogni minuto per 3 minuti.
Se A3-A2=A2-A1 allora puoi procedere, altrimenti devi diluire l'enzima da dosare.
La variazione di [substrato]/1minuto=(A2-A1)/(T2-T1)*1/K*l
K= 1/coefficiente d’estinzione molare di NADH di 340 nm per un
l= cammino ottico |
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15111985
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 17:14:39
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grazie mille per la spiegazione, sei stato molto chiaro...fammi capire se ho appreso ttto correttamente:
se la variaz.assorbimento/min del mio campione = 0,2
coeff.estinz.molare = 6,32
e cammino ottico = 1
le unità di enzima contenute nel mio campione sono = 0,2/6,32 *1 ????
Inoltre ti chiedo un parere, dato che mi è stato richiesto di calcolare l'attività enzimatica con curva di taratura e non atraverso la formula, se io conosco le UNITA'/MG ENZIMA PURO posso seconde te costruirmi la curva di taratura in relazione all'assorbanza e poi per interpolazione calcolarmi direttamente le unità quidi l'attività enzimatica presente nel mio campione?Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
Gosh bataman
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Messaggio inserito da 15111985
ciao a tutti...ho già letto le altre discussioi riguardo al saggio di attività enzimatica...ma io ho ancora qualche problema...
in laboratorio devo calcolare l'attività di un enzima contenuto in alcuni farmaci in particolare l'attività della bromelina...è la prima volta che devo fare un dosaggio enzimatico...
Non capisco bene cosa vuoi calcolare. Vuoi eseguire una cinetica enzimatica, oppure dosare un analita con un saggio endpoint
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se utilizzo la formula "VARIAZIONE O.D." AL MINUTO/ ASSORBIMENTO DI 1umol/ml DI ENZIMA" per calcolare l'assorbimento di una umol/ml devo inserire questa concentrazione nella provetta e calcolarlo con lo spettrofotometro??
sembrerebbe che vuoi eseguire una cinetica enzimatica, allora il tuo analità è un enzima e il dosaggio sarà espresso in termini di unità enzimatica (UE) dove 1 UE è definita come la quantità di enzima capace di trasformare 1micromole di substrato al minuto in condizioni ottimali (Temp, pH, forza ionica e [Substrato] saturante).
Se il tuo enzima è una deidrogenasi puoi seguire la comparsa/scomparsa del NADPH con uno spettrofotometro misurando l'assorbimento a 340 nm
Quindi scegliendo il buffer ottimale e mettendo substrato a palla, ti posizioni davanti al tuo spettrofotometro, misuri l'assorbimento della miscela di reazione (il bianco).Aggiungi un uno sputo di enzima e leggi l'assorbimento ogni minuto per 3 minuti.
Se A3-A2=A2-A1 allora puoi procedere, altrimenti devi diluire l'enzima da dosare.
La variazione di [substrato]/1minuto=(A2-A1)/(T2-T1)*1/K*l
K= 1/coefficiente d’estinzione molare di NADH di 340 nm per un
l= cammino ottico
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 22:03:18
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| guarda la cinetica enzimatica non prevede la curva di taratura con gli standard. Forse quello che ti è stato chiesto è costruire un grafico assorbanza=f(empo). Dovrebbe essere una retta per un certo intervallo di tempo. Il deltaA/deltaT è il coefficiente angolare della retta. Pero poi procedi sempre allo stesso modo per risalire al delta C |
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