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Discussione |
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Lila85
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 03 marzo 2011 : 17:21:57
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Ciao! Qualcuno ha mai usato la RT-PCR per detrminare il numero di copie di un transgene?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2011 : 17:34:06
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Io lo faccio tramite qPCR, per misurare il numero di copie di un transgene nel genomico.
Per le copie di trascritto non l'ho mai fatto. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Lila85
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 03 marzo 2011 : 18:52:06
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Si, forse mi sono spiegta male, anche io devo misurare il numero di copie di un trasgene nel genomico. Si tratta di topi transgenici.
Che tipo di curva di calibrazione si usa per risalire al numero di copie? Pensavo di preparare diluizioni graduali di DNA genomico contenenti quantita note del mio transgene..Questa tecnica mi e' del tutto nuova e devo partire proprio dalle basi..
Grazie! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2011 : 19:14:17
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La cosa migliore sarebbe avere uno standard cellulare, cioè un clone che ha già in sé
un numero definito di copie del tuo transgene (magari che qualcuno ha già verificato
tramite southern). Con il genomico di quella linea ti costruisci una curva standard
che contenga precise quantità (in ng) in relazione a quelle che carichi a partire dai
tuoi campioni. Poi ci fai due qPCR: una per il tuo transgene e una per un normalizzatore
interno presente a singola copia nel genoma (io uso hTERT, ma penso che vada bene anche
GAPDH o beta actina, prova a controllare). Faccendo il rapporto tra i valori di 2^-dCt
ottenuti dalla tua curva con i valori 2^-dCt dei tuoi campioni otterrai un valore per
ciascuno dei due geni. Normalizzi il valore del transgene su quello del normalizzatore
interno e così ottieni il numero di copie per assetto aploide. |
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Lila85
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2011 : 21:39:21
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Grazie!!!Ok,molto esauriente!! comincio a capire... il problema e' che probabilmente non dispongo di uno standard contenente il mio transgene in un definito numero di copie per costruire la curva.
Ho sentito che qualcuno per costruire la curva usa DNA genomico proveniente dalla linea wild type, al quale vengono aggiunte quantita note di transgene (in pg). Le quanità di transgene da aggiungere ( che corrisponderanno a diversi 'copy number') si possono calcolare con una formula...Non so se questo sia un'alternativa realmente praticabile. Tu sei a conoscienza di questo metodo? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2011 : 21:44:53
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Non esattamente, però so che è possibile fare delle curve con il corrispondente plasmide
di cui puoi dosare con più accuratezza la quantità. Immagino che funzioni, anche se così su
due piedi non riesco a fare tutto il troubleshooting, ma penso che in quel caso ti dovresti
procurare almeno un controllo positivo ad una copia. |
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Lila85
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2011 : 22:23:24
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Ok, potrei clonare il mio transgene in un vettore plasmidico, sequenziarlo per assicurarmi che si sia integrato correttamente, ed usarlo per la qPCR. Laborioso ma potrebbe funzionare...
Speriamo |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2011 : 23:23:20
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Curiosità: ma se è davvero un transgene, com'è possibile che tu non abbia già il plasmide?
cioè- intendo dire -come l'hai prodotto il transgenico? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2011 : 00:07:54
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Curiosità: ma se è un davvero transgene, com'è possibile che tu non abbia già il plasmide?
cioè- intendo dire -come l'hai prodotto il transgenico?
Comprato? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2011 : 01:34:26
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Sono all'antica io!!!  |
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Lila85
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2011 : 10:32:27
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Si, e' una linea di topi transgenici che e' stata creata tempo fa in un altro laboratorio...
Non ho mai avuto il transgene, l'ho amplificato tramite PCR partendo dal genomico, e l ho clonato in un vettore per fare un sequenziamento. Quindi, adesso che ci penso, da qualche parte devo avere un plasmide con gia integrato il transgene.
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