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valia
Moderatore

Prov.: UK

1001 Messaggi

Inserito il - 20 giugno 2004 : 22:07:18

durante il mio tirocinio ho usato il doppio ibrido in lievito usando una proteina nota contro una libreria di cDNA.
Il mio lievito era His3D200, cosi ho potuto usare his3 come gene reporter!! Il problema � che il protocollo diceva di usare una sostanza (3AT=inibitore competitivo dell'enzima prodotto da his3) per impedire la sintesi basale di istidina! Infatti il mio ceppo senza plasmidi cresce benissimo anche senza istidina!!
Ma come � possibile? Forse la sintesi basale avviene da parte del gene reporter perch� a valle c'� un promotore molto forte ???
AIUTOOO!!

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 21 giugno 2004 : 18:34:27

Prova a guardare qui: http://www.nhri.org.tw/nhri_org/mm/main1_3.html

In pratica descrivono un 2-hybrid system che usa his3 come reporter sotto un promotore tet. In questo caso l'aminotriazolo � usato per eliminare la sintesi di base di his quando l'interazione tra le proteine non � abbastanza forte da far produrre abbastanza repressore per bloccare his3.

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valia
Moderatore

Prov.: UK

1001 Messaggi

Inserito il - 21 giugno 2004 : 20:15:14

In realt� il promotore del reporter his3 � esattamente uguale a quello degli altri geni reporter ... almeno da quello che scrivono nel protocollo!!
comunque grazie grazie grazie!! I lieviti mi stanno facendo diventare pazza!!