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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
 Inserito il - 14 ottobre 2006 : 19:23:10
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Colleghi...qualkuno usa questo kit e sa spiegarmi a cosa servono quella specie di siringhe ke escono dalla confezione? Lo so è una domanda banale ma io nn ho mai fatto questo tipo di estrazione.
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Farah |
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2006 : 10:37:42
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A quale kit ti riferisci, a quella plasmidica? RNA? DNA?
Prova a fare un salto sul sito Qiagen
http://www1.qiagen.com/ |
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2006 : 11:24:10
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Io le uso per la purificazione di dna plasmidico amplificato in coli.
Quelle "siringhe" di cui parli altro non sono che colonnine con all'interno una resina a scambio anionico per la purificazione. Il protocollo è molto semplice e la resa è buona.
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2006 : 12:55:51
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Ops...inffetti sono stata molto poco precisa..è il kit x l'estrazione di DNA plasmidico. Quindi partendo dalle mie cellule..dove si lavora? In falcon? e le colonnine a ke punto si usano? Suppongo alla fine! Mah... |
Farah |
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2006 : 13:20:17
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Protocollo Qiagen®:
Pellettare 1 l di cellule batteriche a 4000 g per 15’ a 4 °C.
Risospendere il pellet batterico in 10 ml di Buffer P1.
Aggiungere 10 ml di Buffer P2, mescolare gentilmente per inversione, poi incubare a temperatura ambiente per 5’.
Aggiungere 10 ml di Buffer P3 ghiacciato, agitare immediatamente e incubare in ghiaccio per 20’.
Centrifugare a 20 000 g per 30’ a 4 °C. Rimuovere immediatamente il surnatante contenente il DNA plasmidico e versarlo nella colonnina Qiagen–tip® precedentemente equilibrata con 10 ml di Buffer QBT. Lasciar filtrare per gravità.
Lavare la colonnina con 30 ml di Buffer QC ed eluire il DNA con 15 ml di Buffer QF.
Precipitare il DNA aggiungendo 10.5 ml di isopropanolo 100%. Mescolare e centrifugare immediatamente a 15000 g per 30’ a 4 °C. Eliminare attentamente il surnatante.
Lavare il DNA pellettato con 5 ml di etanolo 70%, centrifugare a 15000 g per 10’. Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet.
Lasciar asciugare il pellet all’aria overnight, poi risospenderlo con ddH2O sterile fino alla concentrazione desiderata.
Nb:le falcon non vanno bene per queste centrifugazioni ad alti g.
Io uso dei tubi speciali da beckmann.
Buon lavoro! |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2006 : 08:34:46
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Grazie 1000 ! Sei stata preziosa!
Si i tubi sono probabilmente quelli ke ho ank'io...le corex Beckman! |
Farah |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2006 : 13:36:53
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Scusa, moonycinzia, perchè non inserisci quello che hai appena scritto sulla sezione protocolli? Daresti un contributo a tutti.
Ciao
tua omonima |
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2006 : 20:19:08
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| Ho usato il kit e nn ho avuto problemi tecnici..ma qual'è la resa ke dovrei aspettarmi? (Io parto da 200/250 ml di cellule) |
Farah |
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2006 : 00:33:39
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Citazione:
Messaggio inserito da Marianna
Ho usato il kit e nn ho avuto problemi tecnici..ma qual'è la resa ke dovrei aspettarmi? (Io parto da 200/250 ml di cellule)
Se ricordo bene con un kit per la maxi puoi arrivare fino ad un massimo di 500ug ma molto dipende anche dal tipo di plasmide(se è multicopia o a basso numero di copie)e dal volume della crescita.Nel mio lab al momento usiamo un kit quaigen nuovo per le mini che ha un buffer che unito a quello di lisi (P1)da una colorazione blu se è avvenuta la lisi e che si decolora quando aggiungi il buffer di netralizzazione(P3).per le maxi invece usiamo un kit della nucleobond e con plasmidi multicopia riesco ad avere una resa di circa 7-8 ug/ul.
per Cin:non ho inserito il protocollo nella sezione apposita perchè è quello del kit e ho visto che già è presente un protocollo per le miniprep qui http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=29(protocollo che io chiamo "per le mini fatte a mano".
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Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2006 : 10:39:56
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| Anke a me il kit fa lo stesso x quanto riguarda la colorazione post lisi...ma il massimo del recupero ke ho ottenuto è 1ug/ul ..il resto è tutto di meno..la cosa mim preoccupa nn poco..uff. |
Farah |
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Kit Quiagen X Maxi Prep
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