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eleda86
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
 Inserito il - 19 marzo 2011 : 18:07:56
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ciao a tutti sono nuova del forum e avrei bisogno di un consiglio.............bè intanto complimenti ho trovato 1000 cose utili qui è veramente un bellissimo forum  ............allora il mio problema è questo:da poco ho sostenuto un esame che mi chiedeva di trovare 2 primers per pcr e calcolare la temperatura di melting..........non so' la mia testa cosa mi ha detto di fare quel giorno, fatto sta che ho trovato 2 primers di 15bp ma le temperature sono uscite di 44 °C  e inoltre i primers contenevano sequenze ripetute ( es: primers:ggggacttc ) volevo sapere, ma è tanto sbagliato avere delle temperature cosi' basse???????? cioè potrei aver trovato dei primers aspecifici???????????? aiutatemiiiiiiiiiiiiiiiii non ho mai fatto pcr in pratica di laboratorio ..........le ho solo studiate quindi non so' se è tanto grave
ps: spero di essere stata chiara 
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theBiochemist
Nuovo Arrivato
Prov.: UK
Città: Leicester
14 Messaggi |
 Inserito il - 23 marzo 2011 : 01:50:48
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Ciao eleda!
Non ho tantissima esperienza nel progettare primers, ma spero di poter darti una mano.
La temperatura di melting e' la temperatura in cui il 50% dei primers si appaiano al DNA che utilizzi come template. Quindi, in teoria, piccole variazioni nella temperatura di melting non dovrebbero comportare grosse differenze in termini di resa della reazione. Detto questo, devi tener conto che l'importanza della temperatura di fusione puo' variare molto in relazione al tipo di PCR. Mi spiego meglio. Dalla temperatura di melting dipende la specificita' dei primers. Se tenti di fare una PCR da un DNA molto puro (per esempio plasmidi purificati), anche se la temperatura di fusione e' bassa, hai comunque buone possibilita' che questo si appai solamente alla regione desiderata. Se, al contrario, tenti di fare una PCR da un DNA piu' variegato (per esempio una libreria di cDNA) a quel punto e' molto importante che il tuo primer sia il piu' possibile specifico, altrimenti rischi di riprodurre frammenti di DNA non specifici che contaminerebbero il tuo prodotto di reazione.
Per quanto riguarda le sequenze ripetute, il problema diventano le strutture secondarie che sono in grado di formare. Questo puo' essere un grosso problema, ma generalmente, in laboratorio, si utilizza DMSO (dimethyl sulfoxide) che previene la formazione ti tali strutture.
PS
Generalmente, io utilizzo primers di 21 basi per le PCR 'normali', ma quando voglio che il primer sia veramente specifico, salgo fino a 30-33 basi.
Spero di non essermi spiegato come un libro chiuso : P Dimmi se hai altre domande : )
Nicola |
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eleda86
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 23 marzo 2011 : 09:06:50
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ciao no no ti sei spiegato benissimo.................la mia sequenza non era di cDNA ma DNA quindi praticamente ho fatto un piccolissimo errore cioè nulla di troppo grave  meno male ,per quanto riguarda le sequenze ripetute io ho messo 4 G ma tenendo presente il fatto di non mettere 4 C ovvero non ho creato primers che si appaiavano magari avevo un primers fatto cosi :GGGGTCAACTect........cioè senza cccc visto che gia avevo gggggg quindi non penso che il proff mi ucciderà per questa cosa o almeno spero.....................posso chiederti un'altra cosuccia???????per caso sapresti spiegarmi la tecnica per creare topi transgenici tramite embrioni tetraploidi??????????????non ci sto capendo moltissimo ............................grazie 1000 per la risp sei stato supergentile |
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theBiochemist
Nuovo Arrivato
Prov.: UK
Città: Leicester
14 Messaggi |
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eleda86
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2011 : 01:43:52
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| grazie lo stesso sei comunque stato utilissimo ................l'esame l'ho passatoooooooooooooooooooooooooooooooo e sono super felice davvero grazie |
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