fattori che afferiscono l'ibridazione durante la pcr

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vd
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4 Messaggi

Inserito il - 28 marzo 2011 : 08:11:57

Se nel genoma ci sono due sequenze geniche ad elevata omologia bisogna prestare attenzione a come si disegnano i primers. Questo perche' potrei amplificare il gene1 pensando si tratti del gene2. Allineando le 2 sequenze vedo che sono altamente simili e questo rende ancora piu' difficile la specificita' della pcr.
Obiettivo: amplificare il gene2 da cDNA sapendo che la sua sequenza ha elevata omologia con il gene1 e che il gene1 e' piu' espresso.
Ho trovato una regione candidata al disegno dei primers, ma il forward termina al 3' con tre A. Che problemi o vantaggi potrebbe darmi? e' possibile che il mismatch che il poli(a) crea in 3' possa in qualche modo favorire l'amplificazione della sequenza di cDNA relativa al gene2 (presente in minore quantita') perche' sto diminuendo la specificita' della reazione di annealing?
Help me!!

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2011 : 00:39:21

Innanzitutto per aumentare la specificit� dell'appaiamento dei primers puoi sia aumentare la Tannealing che diminuire la concentrazione di Magnesio nel buffer. Questi sono i due parametri che in genere si modificano.
Un'altra cosa che puoi fare � fare una PCR Touchdown, fai i primi cicli a temperatura pi� stringente in modo da favorire il prodotto specifico e poi abbassi la temperatura in modo da avere pi� prodotto.

Per quanto riguarda il disegno dei primers, ovviamente dovresti stare in una regione in cui non ci sia una elevata omologia, comunque quello che devi tener presente � questo:
la presenza di G o C al 3' del primers stabilizza il legame del primer al DNA (questo perch� il legame GC � pi� forte di AT), ma non devi esagerare, non ci dovrebbero essere pi� di 3 GC negli ultimi 5 nucleotidi del primer al 3'.
La parte pi� importante del primer � il 3' perch� � l� che avviene la polimerizzazione ed � l� che devi agire per disegnare primers che siano specifici per uno o l'altro gene. Un mismatch al 3' pesa moltissimo perch� se non si appaia quello non avviene la polimerizzazione, quindi posiziona il 3' del tuo primer (basta anche un primer solo) nel punto dove le sequenze sono diverse e fai in modo che sia appai con la sequenza del gene 2 ma non con la 1.

vd
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4 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2011 : 02:47:03

Ti ringrazio tantissimo per il prezioso suggerimento!