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Discussione

jovy
Nuovo Arrivato

102 Messaggi

Inserito il - 07 aprile 2011 : 21:29:16

Salve a tutti...
Ho fatto una estrazione di un plasmide da cellule di E.coli...
E' lungo circa 4,7Kb...Purtroppo su gel (agarosio 1%) migra sopra l'ultima banda del marker...(che � di 10kb!). Ho le due classiche bande...quindi la prima � questa di circa 10Kb e la seconda � ancora pi� pesante!
Qualcuno pu� suggerirmi qualcosa...
Grazie

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 07 aprile 2011 : 21:36:22

cosa del tutto normale. Le forme che vedi sono superavvolto, nick relaxed etc... per vederne la corretta migrazione (cio� il corretto molecular weight) lo devi linearizzare

Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Citt�: Roma

83 Messaggi

Inserito il - 09 aprile 2011 : 22:20:39

Non ho capito bene il tuo problema,

gilthanas
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 09 aprile 2011 : 23:42:04

E' chiaro il tuo problema...� una cosa normale anche se normalmente un p� improbabile...

per una "gran sfiga" hai beccato una colonia che probabilmente aveva incorporato s� il tuo DNA plasmidico, ma ha prodotto un CONCATENAMERO o MULTIMERO...
ossia una DNA circolare a doppio filamento ma che contiene pi� di una copia del tuo plasmide in questione...2 o pi� concatenate insieme...quindi molto pi� pesanti dell'atteso se corso su gel d'agarosio...

in questo caso la linearizzazione (cosa utilissima per conoscere l'esatte dimesioni di un plasmide) non servirebbe a nulla....spezzerebbe queste concatenazioni riportando il tuo plasmide alle dimensioni attese...ma non ti farebbe rendere conto delle dimensioni totali del plasmide...

...se vuoi puoi provare a ricaricare il tuo plasmide insieme ad uno di dimensioni note che hai in lab di cui sei sicuro delle dimensioni per escludere che il tuo problema sia stato di corsa...perch� ogni tanto i superavvolti possono fare certi scherzi per esempio se il buffer di corsa � un p� vecchio o non preparato correttamente...

l'unico consiglio che mi sento di darti � solamente ripartire dalla piastra della trasformazione e riprendere un paio di altre colonie, espanderle e fare altre 2 mini-preps...tutto qui...
ma hai avuto proprio sfiga...per� capita....