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Limpet
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Prov.: Roma
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83 Messaggi |
 Inserito il - 09 aprile 2011 : 20:37:18
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Mi sento davvero stupida, ma non so come fare questo calcolo, anche guardando le vostre precedenti spiegazioni.
Non ho problemi a portare il mio stock di Primers che è a 100µM a pM o ug/nmol...e via dicendo.
Ma come passo dai miei 100µM/L a 50ng/µL?
i miei primers sono di 20bp, quindi 6490 gr/mol e...poi?
come sempre, grazie 
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2011 : 20:53:18
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Ma mi serve la sua OD, forse? con oligocalculator per il mio primer:
AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
mi dice che è 4677 |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2011 : 21:12:03
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2011 : 21:35:14
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Scusate io intanto continuo a provare da sola a darmi risposte. L'importante è non sentirsi soli....
Allora: i miei primer sono a 100 µmol/L, moltiplico x PM (6490 gr/mol)
quindi per avere nella mia reazione di 40 µL (vf) i primer a 50ng/µL dovrei fare:
50x40/0,649 µL = 3333,3 non mi trovo!
 
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2011 : 22:18:34
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....ma sento che ci sono vicina...
il mio scopo, capire come arrivare a 50ng/µL di Primer dal mi stock a 100 µmol/L
mM=mmol/L
PM=mol/L
mM/PM e ho il risultato in mg/L
100 µmol/L = 100.000 mmol/L
PM primer:0.00649 mg/mol
........... |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2011 : 10:36:31
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| Help!! |
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ello82
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: Neviano
34 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2011 : 15:12:48
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| ciao! scusa ma non ho ben capito il dilemma. tu hai la tua madre a una determinata concentrazione. hai fatto l'intermedia di 100 uM e tu la vuoi portare a 50 uM? in questo caso ti basta una diluizione 1:2 ovvero prendi 1 uL e ne aggiungi uno di acqua. ovviamente per un volume più corposo come 100 uL (per esempio) basta prendere 50 uL di quella a 100 uM e ci aggiungi altri 50 uL di acqua. Se ti può essere utile sfrutta la formula M(iniz) * V(iniz) = M(finale) * V (finale). Inserendo i miei dati ho 100uM*x= 50uM*100 => 5000/100= 50uL di stock da prelevare. Spero di essere stato chiaro. |
Life's too short to grieve in sorrow.Fate is waiting for your soul.Live your life like no tomorrow.Worth you're while until gone. By Angra |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2011 : 16:16:03
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il mio problema non sono le diluizioni, ma capire a quanto corrispnde in 50 ng/µL ripetto al mio stock madre, ovvero portarlo a una quantità confrontabile!
Scusa, ma vuoi dire che 50 nanogrammi/µL è 50 µM???
Ma allora sono un ebete...?  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2011 : 19:38:24
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Uffi ieri sera ti avevo risposto, ma poi mi si è cancellato tutto!
Comunque...
6490 gr/mol immagino che sia il valore che c'è scritto sul data sheet del primer (altrimenti usando il valore medio otterresti per un primer di 20nt 6600)
Il tuo ragionamento in linea di massima è giusto, ma ti sei persa con qualche concentrazione:
Citazione:
Messaggio inserito da Limpet
50x40/0,649 µL = 3333,3 non mi trovo!
dovrebbe venirti alla fine circa 3µL, avrai sbagliato qualcosa per cui ottieni un risultato 1000 volte superiore.
I conti comunque sono questi:
PM = 6490 gr/mol = 6490 µgr/µmol
100µM = 100µmol/L
moltiplicando per il PM ottieni la concentrazione della tua soluzione iniziale il gr/L (o sottomultipli)
100µmol/L x 6490 µgr/µmol = 649000 µgr/L
che corrispondono a 649 µgr/mL che sono 649ng/µl
a questo punto hai espresso la tua concentrazione iniziale in ng/µl come quella finale che vuoi ottenere e puoi applicare la formula, alla fine ottieni:
50ng/µl : 649ng/µl x 40µl = 3.08µl
come vedi tu avevi scritto:
Citazione:
50x40/0,649 µL = 3333,3
0,649 al posto di 649, era solo quello l'errore! |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2011 : 20:13:21
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Alle conversioni mi inceppo sempre....grazie!! sei sempre fondamentale! anche l'altra volta mi hai aiutato,
Sò felice!c'ero quasi!!
bacibaci,a buon rendere,
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2011 : 20:20:34
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| Un' ultima cosa. Ma quindi se ho 2 primer (F e R) di mer differenti, 1 di 20 e l'altro di 23, dovrò immaginare, volendo sempre lavorare a 50ng/µl per ciascuno, di mettere 2 volumi differenti. Ovviamente. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2011 : 00:38:37
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Beh se hai i primers in una concentrazione espressa in µM e li vuoi utilizzare ad una concentrazione espressa in ng/µL e la lunghezza dei due primers (quindi il PM) è diverso, allora sì, i volumi saranno diversi.
Anche se probabilmente non saranno diversissimi.
Ad es. considerando 2 primers di 20 e 23nt e calcolando il PM con il peso medio avrò che:
20nt PM= 6600
23nt PM= 7590
quindi riprendendo i conti di prima ottieni questi volumi:
50ng/µl : 660ng/µl x 40µl = 3.03µl
50ng/µl : 759ng/µl x 40µl = 2.64µl |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2011 : 07:03:35
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Eh bè, si....merci
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2011 : 07:14:52
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anche se....mi sembra uan quantità enorme....
Ho ripreso infatti un vecchio protocollo per una pcr dove richiedevano 100ng(immagino/µl) di primer e il mio capo nel volume di reazione mise 1 µl....forse è /L.... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2011 : 19:34:21
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Beh bisognerebbe vedere esattamente in quel protocollo quali erano le concentrazioni, comunque tieni presente che in una razione di PCR si utilizzano in media (poi varia a seconda dei casi) i primers ad una concentrazione finale di 0,5µM.
Ciò vuol dire che se se hai un primers di 20nt PM = 6600
0,5µmol/L x 6600µg/µmol = 3300 µg/L che sono 3,3 ng/µl |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
 Inserito il - 12 aprile 2011 : 21:16:18
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appunto, quelli in questo protocollo di cui ti parlavo sono una barbaridad!(termine spagnolo per dire... una caterva infinita...)
Diceva:The 50 µl PCR reactions were performed using 2.5U of Goldstar Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Belgium), 0.05mM of each dNTP, 100 ng of each primer, 2.5mM MgCl2 and 1 µl of extracted DNA....
vorrebbe dire, essendo un 20nt, 7,57µl!! su un vf 50....ehh!! |
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Concentrazione primers, aridaglie!
Didattica
