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ammonimmo
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Inserito il - 13 aprile 2011 : 17:30:34

Salve a tutti, ho un problema col protocollo per il cariotipo che mi hanno suggerito. Le mie cellule bersaglio sono fibroblasti e cellule epiteliali, quindi cellule senza difficolt� di crescita o particolarmente suscettibili...ma una volta che finisco il protocollo, il 98% di nuclei rimangono integri, senza rivelare i loro cromosomi, ed � frustrante!
Vi spiego il protocollo che seguo:

- incubare fiaschetta a confluenza con 500ul di colcemide 10um/ml overnight
- raccogliere con tripsina e pellettare le cellule
- risospendere il pellet in 1ml KCl 75 mM e lasciare a 37 �C per 15'
- centrifugare per 10' a 600 g
- eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di fissativo (acido acetico + metanolo 1:3) lasciando agire per 10'
- centrifugare a 600 g per 5'
- eliminare il surnatante, risospendere in 1 ml di fissativo e ripetere centrifugazione a 600 g per 5'
- eliminare il surnatante e risospendere in 200 ul di fissativo
- distribuire goccia a goccia sui vetrini portaoggetto e lasciare asciugare
- colorare con Giemsa e montare i vetrini

Ora vi chiedo: cos'� che non v� in questo protocollo? Avete un'idea del perch� i nuclei non scoppiano? Serve forse un trattamento con calore/freddo per procurare uno shock alla membrana nucleare? Se s� come e a che punto del protocollo?
Conoscete altri protocolli alternativi, escludendo il chromosome painting?
Grazie a tutte le risposte utili!