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Limpet
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 Inserito il - 13 aprile 2011 : 20:21:10
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Ciao a tutti di nuovo, ormai siete il mio riperimento fisso e mi fa piacere avere con chi discutere, cosa che in lab mi manca molto.
Ho una sequenza, ottenuta non per clonaggio, ma diretta che volevo mettere in banca dati. E' una cds, la citocromo ossidasi, e da ignorante, ho fatto una submission in Genbank per avere la referenza per un articolo, dopo avere avuto conferma da blast che fosse la specie che immaginavo fosse. In genbank mi hanno detto essere piena di codoni di stop, che non può avvenire in una coding!! Era una sequenza pulita, non ci ho lavorato molto.Così oggi l'ho tradotta con bioedit e mi mette in alcuni punti fra gli aa degli asterischi: TAHAFVMIFFLECQF*SEDLEIDLFPYI*GLQIWPSLD.
Andata in blast con la sequenza tradotta, me la riconosce come citocromo ossidasi.
Le mie domande sono: cosa sono gli asterischi? e come vedo dove sono i codoni di stop? e quindi, come non ripetere lo stesso errore...?
grazie
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2011 : 20:52:45
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| ma è piena di codoni di stop in tutti i frame di lettura? |
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2011 : 21:46:51
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Questa è una cosa che ho già sentito..., cioè?
quando vado in bioedit, seleziono la sequenza e faccio: translate in selected frame, e traduce!
invece? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2011 : 22:53:13
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dico che se la fai tradurre nel frame nn corretto, è chiaro che ti da un sacco di codoni di stop! dovresti tradurla nel frame corretto. Mi sorgeva questo dubbio perchè hai detto che con il blast ti ha dato il risultato che ti aspettavi, ossia la citocromo ossidasi. Ma il blast sulla sequenza nucleotidica ti allinea la sequenza senza tradurla (a meno che nn faccia il blast tn, se non erro, che però credo ti traduca in tutti e 6 i possibili frame - 3 senso e 3 "antisenso").
Io ho conoscenze molto limitate di bioinformatica, quindi ti suggerisco di chiedere a qualcuno piu' esperto. A mio avviso però il tuo è solo un problema di individuare il frame corretto. Al tuo posto, procederei così: traduco la sequenza in tutti i possibili frame (su ExPASy trovi ottimi tool come questo http://expasy.org/tools/dna.html) poi tra tutti i possibili 6 frame guardi quello che ti da la sequenza amminoacidica aspettata, a rigor di logica con un solo codone di stop (se la sequenza è la sola ORF senza ulteriori UTRs). Per essere sicuro puoi comparare la sequenza aa ricavata con quella già depositata della citocromo ossidasi (sempre che sia stata depositata e che si tratti della stessa). |
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Limpet
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83 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2011 : 23:10:23
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...medito sulle tue parole....e ti faccio sapere,
grazie |
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chick80
Moderatore
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11491 Messaggi |
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Limpet
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83 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2011 : 10:54:17
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Ho fatto già sia blast-p che blast-n. In pratica io utilizzo la sequenza della citocromo ossidasi come barcoding per identificare una specie, un idrozoo, in particolare, e, sia a blast-p che blast-n mi danno come risultato citocromo ossidasi e la specie che mi aspettavo.
nella sequenza con gli asterischi, e ne ho tanti, ho:
FLIIFDNNF*IKLKGRGNLDRDNVA*SLAI*LMDSMNG*TNIPLS*RESKKIEIVVKMLFKIVRRKDPIELHYTLFITNETYFLN*GVW*FSWGDYFLNLTKASNVNDKFTV*LNFLTVINIGHNDPLCFQN*TQRSIDKSYLRDNRIILF*SSYRK*SLSPLC*I
sono andata su Expasy, come consigliava Spemann, e in tutti i frame mi da codoni di stop. Ma la cosa forte e che mi la da anche per la sequenza che in genbank mi da come massima identità (98%), ed è sempre una cds!
Non so più dove mi incarto! Ma poi, non capisco una cosa: perchè ho 6 frame di lettura per una sequenza? |
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Limpet
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Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2011 : 11:33:22
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| Ok, ho capito perchè ho 6 frame di lettura, sorry per l'ignoranza. Sono algi inizi e il mio utilizzo di questa materia è limitato... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2011 : 19:55:44
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| beh, generalmente asterisco=codone di stop |
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Limpet
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Inserito il - 14 aprile 2011 : 20:05:04
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come lo vedo in modo rapido? o conto sequenza e triplette manuale..? |
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ipa
Nuovo Arrivato
67 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2011 : 20:17:13
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| Dunque mi sembra assodato che se contiene codoni di stop non è un cds...Il fatto che tu trovi un'identità del 98% mi fa pensare (e lo puoi verificare tu dall'allineamento della sequenza su blast-n ) che ci siano in alcuni punti della tua sequenza dei "gap" rispetto al gene di riferimento (ovvero delle differenze nucleotidiche) corrispondenti molto probabilmente ai tuoi stop quando la traduci in proteina. Quindi blast ti dice che la tua sequenza corrisponde ad una citocromo ossidasi (98% di identità!) ma la sequenza non è tutta giusta!Comunque se ci scrivi la sequenza nucleotidica ci risulterà più semplice risponderti. |
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Limpet
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Inserito il - 24 aprile 2011 : 12:03:44
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Vi allego il file....?ma posso allegare qui?
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Limpet
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Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2011 : 16:51:33
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| fatto! |
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Limpet
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Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 28 aprile 2011 : 23:21:58
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| ti ho inviato il file in forma privata, ti è arrivato? |
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Sequenze codificanti e codoni di stop
Didattica
