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jovy
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 Inserito il - 19 aprile 2011 : 14:44:56
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oggi ho preparato delle cellule competenti. Non dovendole usare presto ho deciso di congelarle in DMSO.
Alle cellule (AD202) risospese in CaCl2 (2ml) ho aggiunto prima 70microL di DMSO, ho lasciato 15min in ghiaccio e poi ne ho aggiunti altri 70(microL di DMSO). A questo punto ho aliquotato e messo in ghiaccio e poi subito a -20°C e a -80°C.
Il protocollo (del Sambrook) diceva che appena aliquotate andavano in azoto liquido, cghe io non avevo. Secondo voi ho perso tutto?Oppure ho semplicemente una resa minore?
Grazie in anticipo!
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gi |
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vuamour
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Inserito il - 21 aprile 2011 : 11:04:33
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Citazione:
Messaggio inserito da jovy
oggi ho preparato delle cellule competenti. Non dovendole usare presto ho deciso di congelarle in DMSO.
Alle cellule (AD202) risospese in CaCl2 (2ml) ho aggiunto prima 70microL di DMSO, ho lasciato 15min in ghiaccio e poi ne ho aggiunti altri 70(microL di DMSO). A questo punto ho aliquotato e messo in ghiaccio e poi subito a -20°C e a -80°C.
Il protocollo (del Sambrook) diceva che appena aliquotate andavano in azoto liquido, cghe io non avevo. Secondo voi ho perso tutto?Oppure ho semplicemente una resa minore?
Grazie in anticipo!
Ciao, io non ho moltissima esperienza con le cellule però ho congelato in DMSO migliaia di cellule staminali umane. Ti posso dire che il DMSO è tossico per le cellule per cui appena lo aggiungi devi porle a -80°C e quando le scongeli devi avere cura di considerare la catena del freddo. In pratica devi scongelarle lentamente ponendole dal -80°C a +37°C in bagnomaria . Considera che con tutti questo accrogimenti io avevo una perdita di cellule vive di circa il 20-30%.
Secondo me da quello che leggo non credo prorpio che recupererai tanto anzi penso porpio che le tue cellule siano morte. Tuttavia non tiscoraggiare. prendine un'aliquota, lavale con PBS e guardale al microscopio. Le cellule vive ti apparirianno con un pallino luminoso rilevato, le cellule morte si presentano di solito di colore marrone a diverse gradazioni e con un apsetto schiacciato sul fondo. |
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jovy
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102 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2011 : 11:42:56
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Anche io ho lavorato con cellule eucariotiche e quando congelavo in DMSO facevo li stessi passaggi: subito in ghiccio, -20°C, dopo qulache ora a -80°C e il giorno dopo in N2 liquido. Ti proccupa lo step di 10min in ghiaccio? QUnad'è che secondo te le ho uccise? Questi primi 15min erano previsti dal protocollo che ho usato preso sul "molecular cloning".
Se c'è anche qualcun altro che vuole aiutarmi!
Grazie.
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gi |
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GFPina
Moderatore
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8408 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2011 : 20:15:19
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Un conto è lavorare con cellule eucariotiche un altro BEN DIVERSO è lavorare con batteri!
Visto che qua stiamo parlando di batteri (E. Coli AD202) bisogna utilizzare protocolli per batteri!
Detto questo, per i batteri a differenza degli eucarioti, e sopratutto se si tratta di cellule competenti è "essenziale" congelare le cellule immediatamente, non gradualmente!
Il protocollo del Sambrook infatti ti dice di congelarle immediatamente in azoto liquido (questa è la pagina)
se non hai l'azoto liquido a disposizione (che è comunque l'opzione migliore) puoi utilizzare altri metodi di congelamento rapidi:
- preparare un soluzione di etanolo/ghiaccio secco in cui immergere le provette per congelarle
- mettere le provette "subito" in ghiaccio secco, anche se utilizzare etanolo/ghiaccio secco è meglio
se proprio non hai neanche il ghiaccio secco puoi metterle "subito" nel -80°C, o anche preparare una bacinella con etanolo nel -80°C (diventerà un po' gelatinoso) e immergerle lì prima di deporle in una scatola nel -80°C.
Insomma... più rapidamente si congelano meglio è!
Tu le hai tenute in ghiaccio mentre mettevi il DMSO e fin qui va bene, non so per quale motivo hai aggiunto in 2 volte il DMSO (magari è una versione diversa del Sambrook e hanno modificato leggermente il protocollo) comunque sia i 15 min. in ghiaccio vanno bene, ma poi non dovevi metterle a -20°C ma congelarle rapidamente!
In ogni caso non credo siano completamente rovinate ma probabilmente l'efficienza è molto bassa, dovresti a questo punto testarla. |
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jovy
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102 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2011 : 13:17:32
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Grazie GFPina...
Non ho a disposizione neanche il ghiaccio secco...
Comunque prima di quesllo step che mi hai indicato il protocollo del Sambrook che ho usato io (terza edizione, forse la tua ¨¨ la seconda?) recita cos¨¬:
a. Add 140¦Ìl of DMSO per 4ml of resuspended cells (io ne ho usati 70 perch¨¨ avevo 2ml di cells). Mix gently by swirling, and store the suspension on ice for 15 minutes.
b. Add an additional 140¦Ìl of DMSO to each suspension. Mix gently by swirling, and then return the suspensions to an ice-bath.
c. Working quickly, dispense aliquots of the suspensions into... (qui continua come da te indicato)
Per questo ho operato in questo modo...
Circa 20min dopo averle preparate sono arrivate a -80¡ãC.
Come si testa l'efficienza delle cellule competenti?
Grazie come sempre
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gi |
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GFPina
Moderatore
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