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reginella
Nuovo Arrivato
Città: napoli
7 Messaggi |
 Inserito il - 19 aprile 2011 : 17:48:55
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ciao a tutti,
ho letto diverse discussioni sull'estrazione del dna con questa tecnica ma,onestamente,mi mancano dei passaggi.mi spiego:voglio capire perche si usa il fenolo?so che ha la funzione di denaturare le proteine,ma quali?le proteine istoniche?in che modo?perchè si parla di fenolo tamponato
e il cloroformio, a cosa mi serve?come interferisce?poi,non ho finito....
il Dna si dispone nella fase acquosa,giusto?perchè?potete spiegarmi i dettagli di questa tecnica?so che non è difficile ma voglio capire qual'è la funzione dei vari componenti.grazie raga..siete fantastici,resto sempre colpita da tutte le cose che sapete!
reginella
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Limpet
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
83 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2011 : 12:28:03
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Cara Reginella,
Un metodo classico per effettuare l'estrazione di acidi nucleici prevede l’uso di solventi organici come fenolo o cloroformio, e consta di diverse fasi:
1.LISI DELLE CELLULE.
E’ necessario liberare il DNA e l’RNA dall’involucro nucleare. Per permettere al DNA di uscire dalla cellula e di srotolarsi senza perdere la struttura ad elica, occorre sia demolire pareti e membrane cellulari, che allontanare le proteine attorno alle quali il filamento di DNA si avvolge e si ripiega ripetutamente su se stesso. I metodi tradizionali di lisi si basano su trattamenti complessi che includono la solubilizzazione tramite detergenti: si rompono i tessuti con pestelli in un buffer di estrazione conteneti detergenti (SDS, EDTA…..) sono tutti detergenti che in misura diversa, solubilizzano le membrane lipidiche, denaturano le proteine e le dissociano dagli acidi nucleici.
2.ELIMINAZIONE DELLE PROTEINE. il DNA all’interno del nucleo è legato ed associato a proteine che contribuiscono a determinarne la struttura: gli istoni. Per isolarlo occorre distruggerle. La soluzione di DNA e proteine va trattata con sostanze che le denaturino, in genere Proteasi come la K.
3.FASE DI PURIFICAZIONE-SEPARAZIONE E RECUPERO DELL’ACIDO NUCLEICO dalla soluzione contenente il lisato cellulare. In pratica al lisato cellulare contenete l’acido nucleico (DNA o RNA) in soluzione si aggiunge fenolo saturo e cloroformio, si vortexa e si centrifuga fino ad ottenere una fase acquosa (surnatante) contente DNA o RNA e fenolo cloroformio che trattiene le proteine. In pratica, sfruttando la capacità degli acidi nucleici di preferire soluzioni acquose, immiscibili con i solventi organici, lo si fa passare dall’estratto cellulare (DNA + Proteine) alla soluzione acquosa, tramite la costrizione di 2 fasi:
1) fase acquosa (DNA+ acqua) (surnatante)
2) fase organica proteine e solventi organici (sotto)
Nella miscela fenolo/cloroformio
il Fenolo: è un forte denaturante delle proteine che le lega mediante legami H, elimina i residui proteici e lipidici (si procede spesso con una o più estrazioni fenoliche) in quanto il fenolo legandosi al core delle proteine ne causa la loro denaturazione, alterandone la struttura. Le proteine denaturate, con i gruppi idrofobici esposti, diventano solubili nella fase fenolica o precipitano all’interfase fenolo-acqua; inoltre è un solvente dei lipidi e delle molecole di RNA contenenti lunghi tratti di poli(A).Il fenolo è fortemente igroscopico e deve essere sempre equilibrato con una soluzione tampone perché altrimenti assorbirebbe la soluzione acquosa contenente gli acidi nucleici.Tende ad ossidarsi facilmente assumendo un colore rossastro per la presenza di chinoni.
Il cloroformio: denatura e stabilizza l'interfaccia; completa la denaturazione delle proteine, rimuove i lipidi e, grazie alla sua elevata densità, facilita la separazione della fase acquosa (contenente il DNA deproteinizzato) da quella organica (fenolica) stabilizzando l’interfaccia tra le due fasi.
4. PRECIPITAZIONE ACIDI NUCLEICI: Avviene di solito in alcool etilico e permette il recupero degli acidi nucleici in forma solida dalla fase acquosa - si aggiunge l’etanolo, che sequestra l'acqua, si congela, si centrifuga, fino a ottenere un pellet (DNA o RNA) e un surnatante di Etanolo che si elimina.
Gli acidi nucleici poi si risospendono in acqua bi-distillata sterile.
Spero di essere stata esauriente! |
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Estrazione fenolo cloroformio del DNA
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