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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 29 aprile 2011 : 23:56:09
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Semplicemente le elettroforesi native sono elettroforesi condotte in maniera tale da mantenere la struttura secondaria, terziaria ed eventualmente quaternaria o in complesso con altre biomolecole quali DNA. Ciò perciò implica il mancato utilizzo di detergenti, di agenti riducenti che romperebbero eventuali ponti disolfuro, un rigido controllo della temperatura del campione, sia durante il processo di estrazione sia durante la corsa vera e propria (il sistema va raffreddato in quanto si sprigiona calore per effetto Joule), e del pH, che deve avvicinarsi il più possibile a quello fisiologico per le proteine in esame.
Le proteine migrano perciò in base all'attrito all'interno del setaccio molecolare costruito dalla matrice del gel, attrito determinato dal loro ingombro idrodinamico ossia dalla loro struttura, e in base alla loro carica a quel determinato pH, di cui è responsabile la composizione aminoacidica della proteina ed eventuali modificazioni post-traduzionali. Nota che sussiste un alto rischio di perdere parte dell'informazione contenuta nel campione d'origine: poiché non viene impartita nessuna carica "esterna" alle proteine, solo quelle con la carica opposta all'elettrodo di fine corsa migreranno verso esso, le altre invece si muoveranno in direzione opposta perdendosi nel tampone del secondo elettrodo. Se per banale esempio conducessi una corsa catodica in condizioni non-denaturanti perderai tutte le proteine che avranno carica netta maggiore di zero al pH adottato.
Questa tecnica può essere usata per studiare la conformazione di una proteina, eventuali cambiamenti di conformazione, per isolare complessi macromolecolari ma anche studiare interazioni proteina-proteina o proteina-ligando. Semplicemente quest'ultimo è il caso dell'EMSA (Electro-Mobility-Shift Assay), in cui una proteina, o più facilmente un pool, mantenuta nel proprio folding viene messa in contatto con un'altra biomolecola radiomarcata, come il DNA contenente 32P, anch'essa nella sua struttura 3D e, dopo un certo lasso di tempo necessario perché eventuali interazioni si instaurino, il tutto è caricato su gel. Si corre in condizioni non-denaturanti con un controllo nelle lane accanto, costitutito dalla sola molecola radiomarcata. A fine corsa potrai visualizzare la posizione della banda del tuo campione di interesse rispetto al controllo. Nel caso la banda appaia ad un'altezza maggiore avrai una prova che il radiomarcato ha in qualche modo interagito con una copia o più della tua proteina. Potresti in effetti visualizzare più bande, addirittura, se un numero variabile di molecole interagiscono con il radiomarcato.
Nel caso di elettroforese denaturanti le condizioni di corsa sono meno rigide, esiste cioè una certa elasticità circa il pH, la temperatura (che comunque deve essere mantenuta sotto una certa soglia per evitare la deformazione delle maglie del gel, o evitare di instaurare reazioni deleterie per la fedeltà del tuo campione, quali la carbamilazione delle lisine ad opera dell'urea sopra i 37°C). Usi denaturanti e agenti riducenti, con i primi che possono aumentare sensibilmente la resa del campione da cui estrai le tue proteine. Perdi però il folding proteico. Questo permette in certi casi, come nella SDS-PAGE, di ottenere informazioni sul peso molecolare apparante delle proteine.
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So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Elettroforesi... Chiarimenti
Didattica
