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jovy
Nuovo Arrivato



102 Messaggi
Inserito il - 06 maggio 2011 : 14:15:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jovy Invia a jovy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao!
Ho preparato un plasmide con dei frammenti di interesse...
Ora prima di andare ad utilizzarlo per trasformare cellule batteriche devo fare qualche controllo sull'avveuta ligazione?
Oppure posso già inserirlo nelle cellue e quindi poi avere conferma tramite la crescita delle cellule?
Ad esempio mi sarebbe utile fare una corsa su gel?
Grazie!
gi

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi
Inserito il - 06 maggio 2011 : 14:23:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io generalmente i controlli li faccio dopo la trasformazione (digestione e/o pcr e/o sequenziamento).
Pero' ho visto qualcuno qui sul forum che fa controlli prima della trasformazione, per esempio correndo la ligation su gel. A mio (PERSONALISSIMO) parere, non so quanto ti possa essere utile, date le modeste quantità di DNA che generalmente si usano nella ligation.
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jovy
Nuovo Arrivato



102 Messaggi
Inserito il - 06 maggio 2011 : 14:50:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jovy Invia a jovy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per la risposta immediata!
Quando fai la PCR sulle cellule batteriche fai una estrazione del DNA oppure la fai su un pò di colonia stemperata in un buffer qualsiasi? Perchè a me hanno consigliato di fare così (PCR su colonia stemperata in buffer).
Grazie di nuovo!
gi
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi
Inserito il - 06 maggio 2011 : 15:39:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ho fatto sia colony pcr che "plasmid" pcr.... generalmente preferisco la seconda, perchè ho DNA piu' pulito e piu' abbondante. Vado un po' controcorrente forse, perchè la colony pcr è molto veloce e abbastanza affidabile, pero' a me è capitato anche di avere falsi negativi, solo perchè probabilmente i batteri nn si erano "spaccati" per bene e avevano rilasciato poco DNA. Quindi faccio una mini prep, estraggo DNA e faccio PCR (o digestione con enz di restrizione o ancora sequencing).Poi mi porto avanti solo le colonie positive che mi interessano.
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jovy
Nuovo Arrivato



102 Messaggi
Inserito il - 06 maggio 2011 : 15:41:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jovy Invia a jovy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma come li spacchi i batteri?
Con trattamento al calore?
Perchè io avrei intezione semplicemente di stemperare la colonia in un buffer.
gi
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi
Inserito il - 06 maggio 2011 : 15:47:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si con il calore. 5' a 95°C
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Laurettahappy
Nuovo Arrivato


Città: varese


53 Messaggi
Inserito il - 22 maggio 2011 : 12:16:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Laurettahappy Invia a Laurettahappy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Perchè fai una PCR al posto di una digestione enzimatica sul cDNA della miniprep??
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