Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
lilù
Nuovo Arrivato
28 Messaggi |
 Inserito il - 10 maggio 2011 : 12:12:20
|
salve ragazzi ho bisogno di capire una cosa...
allora..
sul libro c'è scritto"la prima dimensione è la focalizzazione isoelettrica..la seconda dimensione è l'sds page".?????ma perchè?
poi mi dice ancora"nell'SDS page la funzione di stacking gel è svolta dalla striscia di prima dimensione"..ma questo vale sempre?
help me please..
|
|
|
|
|
cidsmoke
Utente Junior
534 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2011 : 13:24:11
|
Allora con l'isoelectrofocusing fai correre su di una striscia in orizzontale..
così:
---------------------------------
Poi a questo gel attacchi un altro gel rettangolare che sarebbe questo:
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
che separa le proteine in base al PM,
Quindi alla fine avrai:
---------------------------------
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
E questo rappresenta i due gel attaccati! |
 |
|
|
cidsmoke
Utente Junior
534 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2011 : 13:35:27
|
| Quindi nel compleso avrai una separazione in 2D,una in pase al PI delle proteine,l'altra in base al PM!Spero di essere stato chiaro! |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2011 : 14:40:26
|
Citazione:
Messaggio inserito da lilù
salve ragazzi ho bisogno di capire una cosa...
allora..
sul libro c'è scritto"la prima dimensione è la focalizzazione isoelettrica..la seconda dimensione è l'sds page".?????ma perchè?
poi mi dice ancora"nell'SDS page la funzione di stacking gel è svolta dalla striscia di prima dimensione"..ma questo vale sempre?
help me please..
Quoto la grafica di smoke, volevo aggiungere che si parla di due dimensioni perché si usano due processi separativi differenti, in serie, e in questo caso ortogonali, perché appunto la strip per l'IEF è posta perpendicolarmente al gel di poliacrilammide.
Non sempre comunque esiste una tale ortogonalità nelle metodiche separative, ciò nonostante si parla comunque di analisi multidimensionali. E' un esempio l'associazione nelle cromatografie HPLC di una fase stazionaria con pendenti idrofobici (Reverse Phase) ad una successiva fase stazionaria costituita da uno scambiatore anionico o cationico (Scambio ionico). In questo caso la corsa dei tuoi analiti segue FISICAMENTE un'unica direzione, quella dell'asse della colonna, tuttavia le molecole subiscono una separazione dovuto all'applicazione di due PRINCIPI separativi diversi (idrofobicità e carica elettrica), che vengono appunto detti anche dimensioni. Con il risultato perciò di aver condotto una cromatografia bidimensionale.
Per la strip: è abbastanza logico pensare di utilizzarla come stacking gel, vista la sua T bassa, nonostante sia ad un pH che non è esattamente il 6.8 impiegato in una SDS-PAGE, ma è piuttosto un pH basico (necessario mi pare per l'attività della Iodoacetamide nel tampone). In questo modo una volta originatosi il campo elettrico le proteine separate in base al loro pI nell'analisi di prima dimensione entrano nella seconda dimensione, rappresentata dal gel stesso. Nota che per garantire aderenza tra i due gel (strip e SDS-PAGE), per evitare la formazione di bolle e ancora per evitare che la strip galleggi nel tampone dell'anodo, si cola sopra la strip, prima di addizionare il tampone, una soluzione di agarosio (credo attorno all'1%). Ovviamente l'agarosio deve essere il più puro possibile e a temperature non troppo elevate).
Ecco, perciò credo proprio che l'uso della strip come stacking sia universale. C'è una sola eccezione, costituita dai molecular weights: questi possono essere posti su una seconda strip, alla sinistra della strip ottenuta in IEF, e ciò avrà il vantaggio di far sì che i MW partano dalla stessa altezza degli analiti, oppure è possibile depositarli in un pozzetto realizzato nello stesso agarosio che tu hai colato per le ragioni di cui sopra. In questo caso però i tuoi MW partiranno più lontani dal Running Gel. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
|
|
|
lilù
Nuovo Arrivato
28 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2011 : 19:52:22
|
vi ringrazio moltissimo per le risposte e per la rapidità con cui me le avete fornite.
Ultimissimissimo dubbio:Se,quindi,l'elettroforesi bidimensionale consiste nell'accoppiare in maniera sequenziale 2 sistemi di separazione(l'IEF e l'SDS-page)non ci potrà essere alcuna elettroforesi bidimensionale senza IEF?nel senso..io sulle mie proteine non posso effettuare direttamente l'sds-page senza aver fatto prima a focalizzazione isoelettrica? |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2011 : 20:39:59
|
Ovvio che puoi fare una SDS-PAGE senza prima IEF, in questo ultimo caso otterrai delle bande di proteine. Nel caso dell'analisi di IEF-SDS-PAGE solitamente ottieni spot (salvo fenomeni di over-focusiig ecc).
Ma puoi anche pensare di fare una analisi elettroforetica in 2D senza IEF. Per esempio si può abbinare una elettroforesi nativa ad una SDS-PAGE.
E' il caso classico dello studio dei complessi della catena respiratoria: prima vengono trattati con blue coomassie, che pur legando le proteine non le denatura e non "smonta" le strutture quaternarie, tuttavia conferisce una carica negativa a tutti i complessi per assicurare che tutti migrino verso il polo positivo. Con questa tecnica, denomiata Blue Native PAGE, separi tra loro i complessi multisubunità, in base al loro diverso ingombro sterico. Quindi effettui un trasferimento dei complessi su gel SDS-PAGE, denaturando i complessi nei vari componenti. La cosa importante per immaginare il processo è pensare che ad ogni lane del gel di seconda dimensione corrisponde un particolare complesso: in questo modo separi i polipeptidi dei vari complessi della catena di trasporto degli elettroni in base al loro peso molecolare apparente in SDS-PAGE.
Ovviamente immagino che il trasferimento necessiti prima di un condizionamento dei campioni, in quanto il blue coomassie dovrebbe andare a disturbare il legame dell'SDS, anch'essa carica negativamente, ma il principio resta valido ugualmente. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
|
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
focalizzazione isoelettrica/SDS page
Didattica e Relazioni
