Differenza Primer PCR standard e Real Time PCR

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nikedea
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2011 : 22:46:27

Salve a tutti,
il mio quesito � semplice e diretto... volevo sapere se esistono ragioni molecolari per le quali dei primer disegnati ai fini di un esperimento di Real Time PCR non sono correttamente usabili per un esperimento di PCR standard diretto ad analizzare la stessa identica sequenza di DNA.
Nello specifico mi si � posto davanti il caso di disegnare dei primer per una Real Time PCR (su un prodotto genico immunoprecipitato in Chip) attraverso il software Primer Express 3.0 e di sentirmi obiettare dai colleghi che quei primer non erano consigliabili per un esperimento di PCR semplice. Ci sono effettive ragioni molecolari di questo? O ragioni legate alle differenze della metodica? O i primer da me disegnati possono essere corretamente usati in maniera indifferente in entrambe le analisi?

Daria85
Utente

678 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2011 : 23:05:17

penso sia principalmente perch� i primer per la real time sono disegnati per interagire con una sonda...

nikedea
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2011 : 23:16:57

In realt� non credo sia questo il motivo... i miei primer per Real Time non sono per una Real time con sonde Taqman, ma con semplice Syber Green...se ho capito bene cosa intendi...

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2011 : 08:11:05

Se usi SYBR Green in generale non dovresti avere grandi differenze.
Non conosco Primer Express, ma sicuramente puoi disegnarli con Primer BLAST.

Ad ogni modo se i primers funzionano non capisco quale sia il problema... forse dovresti chiedere esattamente al tuo collega perch� pensa che i primers non vadano bene in real-time.

In generale il consiglio � di evitare ampliconi troppo lunghi in qPCR: se sei sotto i 150bp sei a posto.

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