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ohsorbole
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: Bologna
15 Messaggi |
 Inserito il - 23 maggio 2011 : 18:35:08
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Ho amplificato lo stesso pezzo di gene in 2 individui di una stessa popolazione e ho mandato i 2 amplificati a sequenziare.
Oggi ho ricevuto le sequenze: le due forward sono uguali tra loro, le due reverse sono uguali tra loro, ma la forward e la reverse di ogni individuo sono diverse (un'inserzione di 6 basi, una delezione di 6 basi più a valle, diverse sostituzioni).
Entrambe le versioni del gene sembrano codificanti, anche se una delle due è decisamente più simile alle sequenze ottenute per altre popolazioni (sia come nucleotidi che come amminoacidi).
Ho pensato a varie spiegazioni, ma nessuna mi convince appieno.
Voi che ne pensate? Vi è mai successa una roba simile?
Silvia
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
 Inserito il - 23 maggio 2011 : 19:21:18
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Scusa potresti spiegare meglio perché non mi è molto chiaro.
Tu hai due DNA, 1 e 2 e dici che le due sequenze forward sono uguali tra loro ok, per intenderci F1 = F2.
Poi dici che anche le 2 reverse sono ugali tra loro, quindi R1 = R2.
E poi dici:
Citazione:
ma la forward e la reverse di ogni individuo sono diverse
qua non mi trovo molto, in che punto non corrispondono? In un punto dove sono sovrapposte? Sei sicura che la sequenza sia bella in quel punto, non è un artefatto? Non può essere che ci sono zone con ripetizioni e sia questa la causa delle inserzioni e delezioni? |
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ohsorbole
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: Bologna
15 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2011 : 10:36:30
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Sì, forward e reverse sono sovrapposte. L'amplificato non è molto lungo (1000 bp), ogni sequenza è attorno alle 900 bp, quindi la sovrapposizione è quasi totale. Non ci sono sequenze ripetute. E' un gene mitocondriale.
Faccio un esempio che spero chiarisca la situazione. F1 e R1 sono forward e reverse dell'individuo 1, F2 e R2 sono quelle dell'individuo 2. Le cose stanno più o meno così (in realtà la distanza tra i due buchi è maggiore di 100 bp, qui ho compattato):
F1 AGTTATCCACATGATTGCATCAATTAGCAGCCAGATTTAGAATAACGCCAG------TCAGTTCA
R1 AGTTATCC------TTGCATCATTTACGAGCCAGATTAAGAATAACACCAGATGCCATCAGTTCA
F2 AGTTATCCACATGATTGCATCAATTAGCAGCCAGATTTAGAATAACGCCAG------TCAGTTCA
R2 AGTTATCC------TTGCATCATTTACGAGCCAGATTAAGAATAACACCAGATGCCATCAGTTCA
F1=F2, R1=R2. F1 è diverso da R1 per l'inserzione, la delezione e varie sostituzioni puntiformi.
Gli elettroferogrammi non sono di qualità eccellente, ma discreta, e comunque le differenze si notano anche in punti in cui sia forward che reverse hanno un elettroferogramma buono, non dubitabile.
Le sequenze sono ben allineabili tra loro e anche con sequenze di altre popolazioni, cioè è evidente che il gene è quello giusto, anche se è presente in due versioni diverse.
Ciò che non capisco è come sia saltato fuori questo risultato. Se ci fossero nel mio amplificato due sequenze diverse (contaminazione? caso raro ma non impossibile in cui mitocondri del padre rimangono presenti?), non dovrei ottenere sequenze sovrapposte illeggibili? o una che prevale sempre sull'altra, che invece rimane come rumore di fondo? Invece qui una delle due prevale nettamente nel sequenziamento col primer forward e l'altra prevale col primer reverse. Boh!
Silvia |
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Sequenze forward e reverse diverse!
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