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perse
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 25 maggio 2011 : 15:50:16
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Ciao a tutti,
Ho veramente bisogno di aiuto perché lavoro ormai da qualche mese e non ho risultati decenti.
Il mio problema è questo; quando faccio bollire i campioni proteici prima di caricarli nel gel mi si forma (dopo 5 min di ebollizione) un precipitato (aggregato) che non riesco a tirare su con il puntale. Questa cosa non mi succedeva prima e non riesco a capire il motivo e cmq la conseguenza di questo è che alla fine la concentrazione di proteine che carico varia da campione a campione (non ho più una b-actina uniforme). Questo non mi succede sempre, lo stesso campione a volte forma questo precipitao altre volte no. La miscela di proteine che ho la ottengo da tessuto pestellando manualmente con azoto liquido e usando come buffer di lisi il ripa (PBS 10x, triton, sds, nadesossicolato, sodio ortovanadato e inibitore proteasi). Nel buffer di caricamento metto il mercaptoetanolo e anche sds. Le proteine le conservo a -80 e le utilizzo per diverse volte (4-5).
Se qualcuno mi da una mano gli sarei veramente grata!!!
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2011 : 16:19:20
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Citazione:
Messaggio inserito da perse
Ciao a tutti,
Ho veramente bisogno di aiuto perché lavoro ormai da qualche mese e non ho risultati decenti.
Il mio problema è questo; quando faccio bollire i campioni proteici prima di caricarli nel gel mi si forma (dopo 5 min di ebollizione) un precipitato (aggregato) che non riesco a tirare su con il puntale. Questa cosa non mi succedeva prima e non riesco a capire il motivo e cmq la conseguenza di questo è che alla fine la concentrazione di proteine che carico varia da campione a campione (non ho più una b-actina uniforme). Questo non mi succede sempre, lo stesso campione a volte forma questo precipitao altre volte no. La miscela di proteine che ho la ottengo da tessuto pestellando manualmente con azoto liquido e usando come buffer di lisi il ripa (PBS 10x, triton, sds, nadesossicolato, sodio ortovanadato e inibitore proteasi). Nel buffer di caricamento metto il mercaptoetanolo e anche sds. Le proteine le conservo a -80 e le utilizzo per diverse volte (4-5).
Se qualcuno mi da una mano gli sarei veramente grata!!!
la cosa migliore da fare in questi casi è un reset di tutto buffer soluzioni e se puoi anche campioni, che cmq ti consiglio vivamente di separare in aliquote in modo da non eseguire continui congelamenti e scongelamenti. Io inizierei dal buffer che utilizzi x bollire i campioni |
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keyv
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2011 : 16:21:42
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| ma che quantità di proteine carichi? |
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perse
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2011 : 16:51:11
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La concentrazione è 65 ug. é troppo?
I buffer invece sono stati ripreparati tutti. |
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thejoint84
Nuovo Arrivato
46 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2011 : 18:30:24
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Con i gel normali puoi caricare parecchio..... io sono arrivato anche a 100 microgrammi quando lavoravo con linfociti B e studiavo chinasi e cicline espresse pochissimo..... se usi gel precasted ci sono limiti.... quelli di una marca strafamosa consentono di caricare 50µg al max.
Io non penso che il tuo problema dipenda dalla quantitá di proteine....
Hai provato ad usare meno glicerolo? magari é quello che ti fa precipitare le prot... o magari sto´ dicendo una fesseria!!!! cmq la concentrazione delle prot non é un problema (almeno a me non m´é mai successo ed ho caricato gel per due anni, tutti i giorni o quasi)... |
http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2011 : 22:00:19
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Citazione:
Messaggio inserito da perse
La concentrazione è 65 ug. é troppo?
I buffer invece sono stati ripreparati tutti.
Mamma mia è una quantità abnorme per un western non credo che sia lacausa dei tuoi problemi ma cmq dimezzala dimezzala.
Una curiosità te la puoi togliere cmq dopo averli bolliti i campioni centrifuga e carica il natante. Risospendi un pellet nel buffer di caricamento 5x, fai bollire nuovamente e carica anche quello in una lane :D |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 10:26:48
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Ciao
Potrebbe essere dna genomico. Prova a sonicare i campioni per una decina di secondi; in alternativa, puoi anche evitare di bollire; dopo che hai aggiunto il loading,incuba a 65°C per una decina di minuti o a RT per 20-30 min. Io lo faccio sempre per le proteine di membrana, che tendono spesso ad aggregare quando vengono bollite.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 16:29:30
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Approfitto di questa discussione per esporre il mio problema. Ho fatto un western blot usando estratti da embrioni di Xenopus. trasferimento su pvdf e Rouge ponceau: non ho nulla. Faccio il blot lo stesso con antibody anti-GFP. Risultato: niente, nemmeno il background.
Ora: questi sono estratti di embrioni congelati e scongelati una sola volta. La prima volta che li ho usati (freschi) hanno funzionato benissimo. Ieri li scongelo, faccio sds page/blot, e oggi la brutta sorpresa...
Cosa puo' essere successo? Che si siano degradati cosi' presto? il buffer usato per l'estrazione è ripa buffer + inibitori proteasi. Non so proprio cosa pensare... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 18:01:20
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Approfitto di questa discussione per esporre il mio problema. Ho fatto un western blot usando estratti da embrioni di Xenopus. trasferimento su pvdf e Rouge ponceau: non ho nulla. Faccio il blot lo stesso con antibody anti-GFP. Risultato: niente, nemmeno il background.
Ora: questi sono estratti di embrioni congelati e scongelati una sola volta. La prima volta che li ho usati (freschi) hanno funzionato benissimo. Ieri li scongelo, faccio sds page/blot, e oggi la brutta sorpresa...
Cosa puo' essere successo? Che si siano degradati cosi' presto? il buffer usato per l'estrazione è ripa buffer + inibitori proteasi. Non so proprio cosa pensare...
prova a fare un coomassie per vedere come sono i tuoi lisati.
Se non l'hai buttata puoi anche controllare la membrana blottata colorandola con Coomassie (trovi il protocollo nella sezione protocolli) almeno vedi anche se hai avuto problemi di blotting. Il coomassie è più sensibile del Ponceau, potersti non vedere niente con Ponceau ma vedere con Coomassie.
Secondo, non so se sia il tuo caso ma che alcune proteine si degradano con il congelamento, per alcuni anticorpi si possono utilizzare solo lisati freschi. A me non è mai capitato, ma una mia collega finlandese aveva questo problema.
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 18:24:56
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Approfitto di questa discussione per esporre il mio problema. Ho fatto un western blot usando estratti da embrioni di Xenopus. trasferimento su pvdf e Rouge ponceau: non ho nulla. Faccio il blot lo stesso con antibody anti-GFP. Risultato: niente, nemmeno il background.
Ora: questi sono estratti di embrioni congelati e scongelati una sola volta. La prima volta che li ho usati (freschi) hanno funzionato benissimo. Ieri li scongelo, faccio sds page/blot, e oggi la brutta sorpresa...
Cosa puo' essere successo? Che si siano degradati cosi' presto? il buffer usato per l'estrazione è ripa buffer + inibitori proteasi. Non so proprio cosa pensare...
Umh colori la membrana e non trovi nessuna banda? hai provato ad aggiungere un campione sicuramente non degradato coem ctr del trasferimento? Potresti colorare il gellozzo dopo che hai blottato oppure fare una bella SDS-PAGE x tagliare la testa al toro (o ranocchio) :D
I love biochemistry |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 19:24:18
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anzitutt grazie GFPina e Martin per i preziosi consigli. Purtroppo non ho pensato a colorare il gel, spinto dal precedente successo, e l'ho buttato. La prossima volta farò un coomassie di sicuro. Per quanto riguarda le membrane, ero cosi' incazzato che le ho fatte a pezzi.
ora c'è una cosa su cui riflettevo: una delle variabili che cambiava, tra questo e il precedente (successful) gel è il transfer buffer: l'ho ripreparato fresco questa volta, seguendo il protocollo che mi dava una concentrazione finale di metanolo pari al 25%. Io ho sempre usato il 20%, ma stavolta mi son fidato del nuovo protocollo e ho usato 25%. Sp che conc. troppo alte di metoh possono impedire il trasferimento delle proteine. puo' essere il mio caso? che ne dite?
grazie ancora! |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 19:58:05
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
anzitutt grazie GFPina e Martin per i preziosi consigli. Purtroppo non ho pensato a colorare il gel, spinto dal precedente successo, e l'ho buttato. La prossima volta farò un coomassie di sicuro. Per quanto riguarda le membrane, ero cosi' incazzato che le ho fatte a pezzi.
ora c'è una cosa su cui riflettevo: una delle variabili che cambiava, tra questo e il precedente (successful) gel è il transfer buffer: l'ho ripreparato fresco questa volta, seguendo il protocollo che mi dava una concentrazione finale di metanolo pari al 25%. Io ho sempre usato il 20%, ma stavolta mi son fidato del nuovo protocollo e ho usato 25%. Sp che conc. troppo alte di metoh possono impedire il trasferimento delle proteine. puo' essere il mio caso? che ne dite?
grazie ancora!
ho sempre usato il buffer al 20% metOH, ma sempre fresco ma non credo che possa dare noie al 25% |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 20:48:14
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| uhmmm ho capito. Beh grazie ancora per il suggerimento. La cosa piu' logica da pensare è che il campione sia degradato, ma tenderei ad escluderlo: se fosse degradato non dovrei vedere uno smear? invece non vedo nulla, membrana (e lastra) praticamente vergini... |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 21:00:06
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| a me sa tanto di blot fallace |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 21:03:49
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| anche a me. quindi escluderesti degradazione proteine? |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 21:29:59
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| si direi di si perchè più che una degradazione sarebbe una disintegrazione anche se in lab mai dire mai |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 21:33:57
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Personalmente ho sprecato pagine e pagine già in questo forum, per dire le seguenti cose:
- la colorazione con ponceau non é molto sensibile e non é raro che non si colori la membrana, motivo per cui io facevo il coomassie se necessario a fine WB
- ruolo di metanolo e SDS nel trasferimento, entrambi possono influenzare il blot (magari se ti interessa e se non trovi i post te li cerco e te li linko), comunque dipende dal PM della proteina che ti interessa.
Comunque sia se non hai finito tutti i campioni e ne hai a sufficienza prima di rifare il WB ti consiglio comunque di fare solo SDS-PAGE e Coomassie, così ti assicuri dello stato dei tuoi lisati.
Stabilito questo ripeti il blot tornando al metanolo al 20% e conserva il gel per un eventuale coomassie, se poi non vedi niente con Ponceau, comunque prima di buttare la membrana fai il Coomassie anche su quella, sì sono un po' di passaggi ma almeno hai modo di controllare tutti gli step.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 21:36:46
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Ah dimenticavo, io non escluderei una degradazione della proteina che ti interessa e di cui non hai avuto risultato in WB, insomma si sa che possono anche andare storte anche più di una cosa in un singolo esperimento ( ovviamente non te lo auguro), meglio controllare tutto!
In bocca al lupo!
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 21:46:48
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| Ma il size marker si è colorato? se non si è colorato molto probabilmente non si è trasferito nulla! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 23:16:28
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@ martin: I marker sono a posto
@GFPina: la settimana prossima, quando rientro dall'italia (parto domani :P) ripeto tutto e faccio pure un bel coomassie. ammetto di non avere molta esperienza con i blot, ma devo farmi le ossa anche su questo :)) visto che il prossimo anno cambio lab e li' di blot ne farò a bizzeffe! :))
Grazie a tutti per i consigli! |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2011 : 23:23:04
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| è sempre un piacere, di blot ne facevo 3 o 4 al giorno ai tempi del PHD un pò mi mancano :D |
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problemi western
Didattica
